一种葵花组培育苗方法与流程

本发明属于植物生物技术及栽培技术领域，具体涉及一种葵花组培育苗方法。

背景技术：

向日葵(helianthusanuusl.)是菊科(compositae)向日葵属(helianthus)栽培种,起源于北美西南部，向日葵大约在16世纪末或17世纪初传入我国，长期以来，向日葵在我国只是零星种植主要作为干果食用，20世纪90年代以来逐步成为我国人民的饮食结构中是食用油的主要来源之一，19世纪80年代初，葵花开始在欧洲被用作为观赏植物，目前已有100多年的栽培历史，从上世纪80年代初，人们开始进行向日葵组织培养研究，直到现在，向日葵离体培养植株再生仍然十分困难，即使能再生重复性也特别差，向日葵的再生途径主要通过器官发生和胚胎发生而产生，向日葵的器官培养从子叶开始到下胚轴、真叶、茎尖等都不同程度的得到了再生植株，这几种外植体中子叶、下胚轴、茎尖较易诱导出再生植株，但是总体上诱导出芽的频率不高，一般在2．5％～12％，而且受各种因素影响，芽不易长成植株。向日葵胚胎培养可以克服远缘杂交的不亲和性、缩短杂交育种世代周期、加快育种进程。

《华北农学报》1993年第8卷第2期中《向日葵未成熟胚培养中不定芽的发生》一文中对向日葵未成熟胚不定芽发生进行了研究表明，自交系、杂交一代和保持系的再生频率高于普通品种。《内蒙古民族大学学报(自然科学版)》2003年第18卷第5期中《向日葵未成熟胚组织培养及再生芽的研究》一文中对未成熟胚的萌动、愈伤组织的诱导、分化及再生苗的培养和移栽等方面进行了研究表明，授粉后10-12天的胚分化成苗率可达73％以上。

江苏沿海地区农业科学研究所从2011年开始从事葵花新品种选育研究，经过多年的选育，目前已经培育出多个具有不同特色的观赏葵花新品系，实践表明单瓣多头葵花容易通过种子繁殖培育性状稳定的自交系，但是对于重瓣多头葵花（黄色单瓣多头葵花、紫色重瓣多头葵花、白色重瓣多头葵花），应用种子繁殖，种子结实率低，后代性状稳定困难，分离严重。

技术实现要素：

本发明为克服重瓣多头葵花品种（黄色重瓣多头葵花、紫色重瓣多头葵花、白色重瓣多头葵花）应用种子繁殖困难，种子结实率低，后代性状难以稳定，分离严重的问题，提出一种以腋芽作为外植体培育向日葵组培苗的方法，并建立了葵花离体培养再生体系。

为解决上述问题，本发明的技术方案如下：

一种葵花组培育苗方法，以葵花的腋芽为外植体，通过组织培养培育葵花苗。

优选地，所述组培育苗方法包括以下步骤：

a.外植体的选择：采集顶花以下叶腋中的腋芽，腋芽的大小不超过1cm；

b.外植体准备：将外植体洗净并消毒灭菌，然后切取5mm左右大小腋芽的顶部作为外植体接种于分化培养基上；

c.诱导和分化：外植体继续培养直接分化成不定芽；

d.壮苗培养：不定芽生长到2～3cm时转移至壮苗培养基上培养；

e.生根培养：不定芽生长到4～5cm时转移至生根培养基上培养；

f.组培苗驯化：组培苗长大发生4～5片叶子，5～6条白色粗壮的幼根长达约1～2cm时，出瓶锻炼移栽。

优选地，所述组培育苗方法，步骤a所述顶花选自具有观赏价值的分枝多的品种。

优选地，所述组培育苗方法，步骤a所述腋芽选自顶花即将开放或者已经开放，容易辨别出花型一致、腋芽生长慢、其它性状一致的植株。

优选地，所述组培育苗方法，

所述步骤b中，外植体用洗洁净洗涤，然后用清水冲洗0.5h,在超净工作台上，先用70%的乙醇浸泡30～60s，然后用10%的过氧化氢或3%的次氯酸钠溶液消毒15～20min，用无菌水清洗3～4次；所述分化培养基为：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培养基；其中，6-ba浓度为1.2mg/l为最优，分化率达到83.5%以上；

所述步骤c中，外植体在培养25～30天直接分化成不定芽，继续培养10～15天当不定芽生长到2～3cm时转移至壮苗培养基；所述外植体的培养条件为：在温度25～28℃，光照1600lx，日光灯每天光照12h的组织培养室中培养，固体培养基含7.5g/l琼脂，灭菌前调ph为5.8～6.0；

所述步骤d中，所述壮苗培养基为：ms+0.3～0.8mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培养基；其中，6-ba浓度为0.6mg/l为最优；培养周期为25～30天；

所述步骤e中，所述生根培养基为：1/2ms+0.5mg/liba培养基；培养周期为25～30天；

所述步骤f中，因较长的根在清洗过程中容易折伤损坏，降低移栽的成活率，因此移栽前先在室内阳光充足条件下先进行不完全开瓶锻炼1天，待组培瓶盖水珠干透，再完全开瓶锻炼2天；开瓶时间不宜超过3天，因为暴露在空气中的琼脂培养基无疑是细菌等微生物的温床，容易感染侵害植株，降低组培苗的成活率。

优选地，所述组培育苗方法步骤f所述的移栽包括以下步骤：经过驯化锻炼的小苗逐渐适应外界条件，用塑料镊子从培养瓶中小心取出幼苗，尽量不要伤到幼根。如果培养基太干，可用自来水浸泡1～2min后再取出。取出后的组培苗用0.1%高锰酸钾浸泡1～2min进行消毒处理，清除组培苗上老化的叶片，再使用脱脂棉在自来水下轻揉幼根。将根部琼脂冲洗干净，以防琼脂残留物导致杂菌滋生感染植株。移栽要提前将栽培基质浇透水。在装好的草炭土+珍珠岩混合基质中用玻璃棒打个小孔洞，将组培苗地下部分五分之四处种植到湿润基质中，注意的是种植深度过深或浅都会影响株型，不利于植株的固定生长和呼吸作用。最后浇水灌透，将移栽苗放到清洁、干净﹑阳光充足﹑通气良好的温室或塑料大棚中。

优选地，所述组培育苗方法中，所述移栽基质选用以彻底消毒，疏松，透水性良好的珍珠岩、河沙或蛭石加草炭土。

优选地，所述组培育苗方法中，移栽后，培植温度维持在20～25℃，湿度为75%～85%，同时要进行短期的30%遮阴措施处理，促进地下部分生根。当植物愈伤组织形成的根已经长出根毛，功能性新根已慢慢长出，提高了吸水能力，可以直接在叶面喷洒施以薄肥。

葵花苗期病害主要是灰霉病和根腐病和茎腐病等，容易引起死苗、烂苗，严重时易造成巨大的损失；优选地，可对其进行有效的防治：

1)加强苗床管理，防止苗床内湿度过大，控制浇水,苗床里空气相对湿度在60～70%；夜间温室内适当加温；苗床温度控制在25～30°c；增加光照强度，并通风换气；

2)药剂处理，发病前喷施70%百菌清500倍液或50%多菌灵500倍液或200倍等量式波尔多液防治，发病后用70％甲基托布津药液或稀释1000倍的50％代森铵药液进行喷治或喷洒，或采用50％代森锌800～1000倍液喷治或浇灌。

优选地，所述组培育苗方法中，穴盘育苗的葵花苗可移栽到大田，移栽方法为：将移栽苗水浇透，连同基质一起挖出，轻拿握住泥土团，把苗根轻放入大田事先开好的穴中，填充压实好土壤。

相对于现有技术，本发明的优点如下：

本发明提出一种以腋芽作为外植体培育向日葵组培苗的方法，相比于选用子叶、下胚轴、茎尖作为外植体，诱导出芽的频率高，达到68%以上，可以直接从外植体诱导出不定芽，每个外植体一次可以增值3～5倍；

繁殖速度快：由于本发明选用多分枝品种作为组培材料，每个单株一次可以采集15～20个腋芽，有些单株可能更多，可以极大的提高组培繁殖速度，缩短建立离体培养再生体系的时间；

组培苗纯度高：由于选取顶花即将开放或已经开放的植株的腋芽作为外植体，可以有效的提高组培苗的纯度，快速建立纯合离体培养再生体系，克服重瓣葵花应用种子繁殖困难，种子结实率低，后代性状不易稳定，分离严重的问题；

由于向日葵是异花授粉植物，在后代中容易产生各种观赏价值高的葵花变异株，本发明对于葵花特异种植资源的保存具有重要意义。

附图说明

图1本发明专利组培适用葵花品种1——黄色普通葵花(单瓣)；

图2本发明专利组培适用葵花品种2——紫芯普通葵花(单瓣)；

图3本发明专利组培适用葵花品种3——白色观赏葵（单瓣）；

图4本发明专利组培适用葵花品种4——黄色菊葵花(重瓣)；

图5本发明专利组培适用葵花品种5——黄色菊葵花(重瓣)；

图6本发明专利组培适用葵花品种6——黄色菊葵花（重瓣）；

图7本发明专利组培适用葵花品种7——黄色菊葵花（重瓣）

图8本发明专利组培适用葵花品种8——彩色观赏葵（重瓣）；

图9本发明专利组培适用葵花品种9——彩色观赏葵（重瓣）；

图10本发明专利组培适用葵花品种10——白色菊葵花（重瓣）；

图11本发明专利组培适用葵花品种11——白色菊葵花（重瓣）；

图12本发明外植体腋芽的采集；

图13本发明外植体接种到培养基；

图14外植体上芽的分化（一）；

图15外植体上芽的分化（二）；

图16不定芽的分化（一）；

图17不定芽的分化（二）；

图18生根培养（一）；

图19生根培养（二）。

具体实施方式

实施例1

葵花品种选择——选择具有观赏价值的分枝多的品种，例如图1-11。

外植体的选择——选取顶花即将开放或者已经开放，容易辨别出花型一致、腋芽生长慢、其它性状一致的植株，采集顶花以下各个叶腋中的腋芽（参见图12），腋芽的大小不超过1cm。

外植体准备——采集好的外植体用洗洁净洗涤，然后用清水冲洗0.5h,之后在超净工作台上，先用70%的乙醇浸泡30～60s，然后用10%的过氧化氢或3%的次氯酸钠溶液消毒15～20min，用无菌水清洗3～4次。然后切取5mm左右大小腋芽的顶部作为外植体接种于分化培养基上（参见图13），分化培养基为：ms+0.6～1.5mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培养基；其中，6-ba浓度为1.2mg/l为最优，分化率达到83.5%以上。

诱导和分化——外植体培养25～30天直接分化成不定芽，外植体上芽的分化参见图14-15，继续培养10-15天当不定芽生长到2～3cm时转移至壮苗培养基；培养的条件为：温度25～28c，光照1600lx，日光灯每天光照12h的组织培养室中培养固体培养基含7.5g/l琼脂，灭菌前调ph为5.8～6.0。

壮苗培养——当不定芽生长到2～3cm时，将不定芽转移至壮苗培养基上培养25-30天；不定芽的分化参见图16-17；壮苗培养基为：ms+0.3～0.8mg/l6-ba+0.03mg/lnaa培养基；其中，6-ba浓度为0.6mg/l为最优。

生根培养——不定芽生长到4-5cm时转移至生根培养基上培养25-30天；生根培养参见图18-19；生根培养基为：1/2ms+0.5mg/liba培养基。

组培苗驯化——当葵花组培苗长大发生4～5片叶子，5～6条白色粗壮的幼根长达约1～2cm时，选择合适的时间便可出瓶锻炼移栽。因较长的根在清洗过程中容易折伤损坏，降低移栽的成活率，因此移栽前先在室内阳光充足条件下先进行不完全开瓶锻炼1天，待组培瓶盖水珠干透，再完全开瓶锻炼2天；开瓶时间不宜超过3天，因为暴露在空气中的琼脂培养基无疑是细菌等微生物的温床，容易感染侵害植株，降低组培苗的成活率。

移栽前准备——经过驯化锻炼的小苗逐渐适应外界条件，用塑料镊子从培养瓶中小心取出幼苗，尽量不要伤到幼根。如果培养基太干，可用自来水浸泡1～2min后再取出。取出后的组培苗用0.1%高锰酸钾浸泡1～2min进行消毒处理，清除组培苗上老化的叶片，再使用脱脂棉在自来水下轻揉幼根。将根部琼脂冲洗干净，以防琼脂残留物导致杂菌滋生感染植株。

移栽基质——育苗栽培基质要求通气空隙度大，选用以彻底消毒，疏松，透水性良好的珍珠岩，河沙或蛭石加草炭土等为宜。

移栽——移栽要提前将栽培基质浇透水。在装好的草炭土+珍珠岩混合基质中用玻璃棒打个小孔洞，将组培苗地下部分五分之四处种植到湿润基质中，注意的是种植深度过深或浅都会影响株型，不利于植株的固定生长和呼吸作用。最后浇水灌透，将移栽苗放到清洁、干净﹑阳光充足﹑通气良好的温室或塑料大棚中。

移栽后管理——温度宜维持在20～25℃左右，湿度为75%～85%左右，同时要进行短期的30%遮阴措施处理，促进地下部分生根。当植物愈伤组织形成的根已经长出根毛，功能性新根已慢慢长出，提高了吸水能力，可以直接在叶面喷洒施以薄肥。

移栽后病害防治——葵花苗期病害主要是灰霉病和根腐病和茎腐病等，容易引起死苗、烂苗，严重时易造成巨大的损失。有效的防治措施主要有：(1)防止苗床内湿度过大，控制浇水,苗床里空气相对湿度在60～70%；夜间温室内适当加温；苗床温度控制在25～30°c；增加光照强度，并通风换气；幼苗的光合和呼吸作用旺盛，则生长健壮，抗病能力随之增强。(2)药剂处理，发病前可喷施70%百菌清500倍液或50%多菌灵500倍液或200倍等量式波尔多液防治，发病后或用70％甲基托布津药液或稀释1000倍的50％代森铵药液进行喷治或喷洒50％代森锌800～1000倍液喷治或浇灌均可。

二次移栽——穴盘育苗的葵花苗，即可移栽到大田，移栽时，先将移栽苗水浇透，将移栽苗连同基质一起挖出，轻拿握住泥土团，把苗根轻放入大田事先开好的穴中，填充压实好土壤。

需要说明的是上述实施例仅仅是本发明的较佳实施例，并没有用来限定本发明的保护范围，在上述基础上做出的等同替换或者替代均属于本发明的保护范围。