本发明涉及诱导植物多倍体的方法，尤其是一种石斛多倍体的诱导方法，属于植物遗传育种领域。
背景技术：
多倍体（polyploid）是指体细胞具有2个以上染色体组的植物。在石斛中，主要采用离体培养条件下，诱导体细胞染色体加倍的方式，获得多倍体。0.03%的秋水仙素溶液浸泡处理齿瓣石斛丛生芽24h，可较好的获得多倍体（齿瓣石斛多倍体的诱导初报，云南植物研究2005,27(5)：552-556）。秋水仙素溶液浸泡春石斛丛生苗诱导染色体加倍中，0.06%秋水仙素处理12h，诱变效果最佳（春石斛的多倍体诱导,园艺学报，2009，36(9)：1381-1384)。以铁皮石斛原球茎为材料，经秋水仙素和二甲基亚砜混合水溶液处理后进行组织培养，可诱导获得四倍体（铁皮石斛四倍体离体诱导和鉴定及生理特性研究，西北植物学报，2013，33（11）：2189-2193）。然而，在离体条件下，进行丛生芽、原球茎等材料处理，普遍存在染色体倍性嵌合体问题，需要采用不定芽诱导技术，不断分割变异植株茎、叶等组织，诱导产生倍性纯合的多倍体植株，操作程序复杂，工作量大。因此，目前急需一种生长周期短的石斛三倍体诱导并进行培育方法。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供了一种操作程序简便、有效的获得石斛三倍体的方法。本发明具体采用如下技术方案：
一种石斛多倍体的诱导方法，步骤为：采用60-90μm的oryzalin浸泡处理授粉后石斛大孢子母细胞和减数分裂时期的石斛蒴果，所述oryzalin浸泡处理持续48-72h，然后用清水清洗去除oryzalin，通过种子无菌萌发及染色体鉴定，从后代中获得三倍体植株。依据石斛大孢子母细胞减数分裂、雌配子体发育与授粉后时间的相关性，浸泡授粉后处于大孢子母细胞、减数分裂时期的蒴果，抑制减数分裂中染色体正常分离，诱导未减数雌配子产生，通过未减数雌配子与正常雄配子受精融合，并针对的进行种子无菌萌发，进而获得三倍体。
进一步地，所述石斛大孢子母细胞和减数分裂时期为授粉后45d-50d。
进一步地，选择石斛杂交种，进入开花期，采用金钗石斛花粉块进行授粉。
进一步地，去除oryzalin后，待果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实进行种子无菌萌发及染色体鉴定。
进一步地，所述种子无菌萌发为用8%次氯酸钠溶液消毒蒴果20min，无菌条件下，切取种子，无菌播种在萌发培养基1/2ms+naa0.5mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+活性炭2000mg/l上，然后转接在壮苗培养基1/2ms+naa0.2mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+马铃薯汁200g/l+活性炭2000mg/l上。
进一步地，待经种子无菌萌发处理的植株生根后，取根尖进行染色体鉴定。
本发明的有益效果如下：
针对现有培育石斛多倍体工作量大、周期长等问题，发明人建立了一种快速获得石斛三倍体的方法。该法采用毒性小的新型染色体加倍剂oryzalin（氨磺灵），依据大孢子母细胞减数分裂、雌配体发育与授粉后时间的相关性，采用oryzalin浸泡处理大孢子母细胞、减数分裂时期的石斛蒴果，抑制减数分裂中染色体正常分离，诱导未减数雌配子产生，待果实成熟，进行消毒、无菌播种后获得无菌苗，经体细胞染色体鉴定，获得三倍体后代。本发明有效解决了常规三倍体培育方法（首先获得四倍体，然后与二倍体植株杂交获得三倍体）培育时间长（至少需要2个植物生长周期）的问题，成功实现在1个生长周期内操作简便地培育获得三倍体，为创制丰富的石斛多倍体新种质提供了技术支持。
附图说明
图1是染色体计数显微镜图；
图中：左边1为二倍体（对照）（2n=2x=38），右边2为三倍体（2n=3x=57）。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实例，而不是全部的实例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有付出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
<1>田间选择石斛杂交种（金钗石斛×铁皮石斛）无病虫害发生、生长健壮的植株为诱导植株。
<2>进入开花期，采用金钗石斛花粉块进行授粉。
<3>授粉后每隔5d取样，显微观察不同授粉时间，石斛大孢子母细胞减数分裂、雌配子体发育进程，观察结果表明，授粉后45d，石斛主要处于大孢子母细胞时期。
<4>授粉后45d，将蒴果放入装有30ml60μmoryzalin水溶液的离心管中进行浸泡处理48h。处理结束后，取出蒴果，用清水清洗，去除oryzalin。其中，60μmoryzalin水溶液按照如下方法事先配制：首先采用少量dmso(二甲基亚砜)溶解所需质量的oryzalin药剂，然后将dmso溶液滴加入蒸馏水中，滴加过程中不断摇匀蒸馏水，保证无药剂析出，液体为黄色，dmso用量为最终配制水溶液的1%。
<5>收获处理果实：待果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘果实。
<6>种子无菌萌发及染色体鉴定：8%次氯酸钠溶液消毒蒴果20min,无菌条件下，切取种子，无菌播种在萌发培养基1/2ms+naa0.5mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+活性炭2000mg/l上，然后转接在壮苗培养基1/2ms+naa0.2mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+马铃薯汁200g/l+活性炭2000mg/l上，待植株生根后，取根尖进行染色体鉴定。检测142植株中，发现3株三倍体。
实施例2
<1>田间选择石斛杂交种（金钗石斛×铁皮石斛）无病虫害发生、生长健壮的植株为诱导植株。
<2>进入开花期，采用金钗石斛花粉块进行授粉。
<3>授粉后每隔5d取样，显微观察不同授粉时间，石斛大孢子母细胞减数分裂、雌配子体发育进程，观察结果表明，授粉后50d，石斛主要处于大孢子母细胞减数分裂时期。
<4>授粉后50d，将蒴果放入装有30ml60μmoryzalin水溶液的离心管中进行浸泡处理48h。处理结束后，取出蒴果，用清水清洗，去除oryzalin。oryzalin水溶液的配备方法与实施例1相同。
<5>收获处理果实：待果实颜色由绿色转变为黄绿色时，采摘蒴果。
<6>种子无菌萌发及染色体鉴定：8%次氯酸钠溶液消毒蒴果20min，无菌条件下，切取种子，播种在萌发培养基1/2ms+naa0.5mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+活性炭2000mg/l上，然后转接在壮苗培养基1/2ms+naa0.2mg/l+水解酪蛋白1000mg/l+马铃薯汁200g/l+活性炭2000mg/l上，待植株生根后，取根尖进行染色体鉴定。检测110植株中，发现1株三倍体。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。