一种高效筛选马铃薯对根结线虫的抗性方法与流程

本发明涉及一种马铃薯对根结线虫抗性评价方法。

背景技术：

随着马铃薯主粮化战略的提出，市场对马铃薯的需求量越来越大，马铃薯种植面积也在扩大。根结线虫(Meloidogyne spp.)是一种重要植物病害，寄主范围广泛，包括马铃薯在内的许多种类蔬菜，由于国内蔬菜大量种植，导致根结线虫迅速传播，根结线虫在南方发生尤其严重，目前根结线虫病害的发生已扩展到东北，势必严重影响马铃薯的生产，而且这种病害一旦发现，几乎没有根治的可能。目前培育抗病品种是防治该病的重要手段，但是现有的马铃薯栽培品种和资源材料几乎没有明确对根结线虫的抗感性，因而在马铃薯的引种和育种中存在盲目性。国内没有马铃薯对根结线虫抗感筛选的文章，也没有相关的筛选标准。只有吴庆丽等(2006)，做了不同光温条件对马铃薯繁殖根结线虫效果的影响和马铃薯培养根结线虫效果的研究试验，马铃薯材料是块茎，种植方式是用140cm×140cm的花盆，这种试验方法对于处理少的试验可行，不适于同时开展大量材料对根结线虫抗感筛选。然而我国现有的马铃薯资源材料主要的保存形式是马铃薯试管苗，有些重要的资源材料没有保存块茎，因此开展我国马铃薯资源材料对根结线虫的抗感评价需要建立一套用马铃薯试管苗为试验材料，并且有相应的栽培管理方法和评价标准的评价体系，并且确保试验方法准确、简单可行。2003年法国Berthou做了马铃薯群体对南方根结线虫抗性筛选，筛选方法是将实生籽种在400cc的营养钵中，接种2龄幼虫10天后，用品红染色，只要2龄幼虫在根内发育就认为是感病品种，但线虫在马铃薯材料根上的繁殖情况不清楚，此外目前国内马铃薯资源材料对根结线虫的抗感没有报道。综上所述目前缺少一种简单可行的同时进行大量的马铃薯材料对根结线虫抗性筛选方法。

技术实现要素：

本发明的目的要解决的问题：国内外马铃薯资源材料和栽培品种对根结线虫抗感性筛选没有一套简单高效的评价方法。

本发明的一种高效筛选马铃薯资源材料对根结线虫的抗性方法，它是按照以下步骤进行的：

首先在组培室内扩繁马铃薯试管苗，将培养的株高和茎粗都一致的试管苗直接移栽到营养钵内，然后每周浇一次营养液，培养60天后接种根结线虫；根结线虫完成一个生活周期后根据植株的评价结果以及块茎的评价结果，判定马铃薯材料对根结线虫的抗感性；

所述的植株的评价结果是依据马铃薯根上的卵块数量、卵量和虫瘿指数进行评价：

1)卵块数量评价

级别：

0级：没有卵块；

1级：1-2个卵块；

2级：3-10个卵块；

3级：11-30个卵块；

4级：31-100个卵块；

5级：≥100个卵块；

抗性评价：

0-3级为抗病材料，≥4级为感病材料；

2)卵量评价：

依据繁殖系数法进行评价，具体如下：

RF＝Pf/Pi；其中，Pf为每株根上卵量，Pi为最初的接种量；

当RF≥1时为的感病材料，当RF<1时为抗病材料；

3)虫瘿指数评价：

0级：无根结；

1级：<10％的根系有根结；

2级：11-20％的根系有根结；

3级：21-30％的根系有根结；

4级：31-40％的根系有根结；

5级：41-50％的根系有根结；

6级：51-60％的根系有根结；

7级：61-70％的根系有根结；

8级：71-80％的根系有根结；

9级：81-100％根系受侵染，有可见根；

10级：100％根系受侵染，没有根，植株死亡；

抗性评价：

0-3级是抗病材料，≥4级为感病材料；

结合卵块数量、卵量和虫瘿指数3项评价指标，3个指标都为抗病的材料，则判定为抗病马铃薯材料；

3个指标有一项为感病材料，则判定为感病马铃薯材料；

所述的块茎的评价结果是依据马铃薯块茎上的雌虫数量进行评价：

块茎收获后清洗、切片、染色、镜检；

抗性评价：

块茎上有雌虫的为感病材料，无雌虫为抗病材料。

最后，若植株的评价结果为抗病材料，块茎的评价结果为抗病材料，则判定为抗病马铃薯材料；若植株的评价结果为感病材料，直接判定为感病马铃薯材料。

本发明的根结线虫完成一个生活周期具体指：根结线虫完成一个生活周期的时间大约为30天左右，但是其生活周期和温度密切相关。为了保证一个生活周期的完成，马铃薯接种南方根结线虫和爪哇根结线虫40天后收获，北方根结线虫45天收获，然后调查虫瘿指数、卵块数量和卵量；在试验中，为了保证准确判定块茎对根结线虫的抗感性，将参试的马铃薯材料根据熟期进行分组，晚熟材料培养80天接种根结线虫，其它材料培养60天接种，并根据熟期选择合适的对照。

本发明包含以下有益效果：

试验材料用马铃薯试管苗，不仅试验材料容易得到而且培养容器大大缩小，占地面积是常规用块茎做试验材料的1/90，同时基质用量是传统方法的1/90。用经过脱毒的试管苗做试验材料，避免了块茎可能带有其他杂菌或线虫的可能性，影响评价结果的准确性，对马铃薯材料的植株和块茎同时进行评价，增加了抗性筛选的准确性。

附图说明

图1为试验二接种植物在温室中的生长情况图片；

图2为试验二收获时的马铃薯植株图片；

图3为试验一为马铃薯块茎被品红染色图；

图4为试验二被亮蓝染色的植株根系图；其中A为卵块。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种高效筛选马铃薯对根结线虫的抗性方法，它是按照以下步骤进行的：

首先在组培室内按常规方法培养马铃薯试管苗，待马铃薯试管苗培养20d左右，长到6-7片叶时，挑选株高和茎粗整齐一致的壮苗作为试验材料；在温室内放置2d完成马铃薯试管苗的适应性培养后进行移栽，移栽到一次性的16cm×14cm的塑料营养钵中，基质为经过121℃，90min高温高压灭菌的沙土混合物(体积比为2:1)；每个营养钵中移栽1株苗，每份材料移栽5盆；温度控制在23-28℃，定植1周缓苗后，每周浇一次营养液；培养60天接种根结线虫，接种量为5000卵/株，整个试验需要重复2-3次。接种后40天通过调查马铃薯根上的虫瘿指数、卵块数量和卵量，马铃薯块茎上的雌虫数量，来评价马铃薯材料的抗感反应。

评价方法：

对马铃薯植株的评价

1)卵块数量(卵块的数量/根鲜重)评价。

级别：参照Nyczepir等(1982)方法略有改动，

0级：没有卵块；

1级：1-2个卵块；

2级：3-10个卵块；

3级：11-30个卵块；

4级：31-100个卵块；

5级：≥100个卵块。

0-3级为是抗病(Resistance R)，≥4级为感病(Susceptible S)

2)卵量评价：参照Mwaura等(2015)的方法。

繁殖系数(Reproduction factor RF)法：

RF＝Pf/Pi(Pf每株根上卵量，Pi为最初的接种量)

当RF≥1时为的感病，当RF<1时为抗病

3)虫瘿指数：参照Bridge and Page(1980)和Wang et al.(2006)的方法略有改动。

0级：无根结；

1级：<10％的根系有根结；

2级：11-20％的根系有根结；

3级：21-30％的根系有根结；

4级：31-40％的根系有根结；

5级：41-50％的根系有根结；

6级：51-60％的根系有根结；

7级：61-70％的根系有根结；

8级：71-80％的根系有根结；

9级：81-100％根系受侵染，有可见根；

10级：100％根系受侵染，没有根，植株死亡；

0-3级为抗病(Resistance R)，≥4级为感病(Susceptible S)。

结合3项评价指标，3个指标都为R的为抗病，三个指标中有一项为S的为感病。

块茎评价：块茎收获后用自来水洗净，每个参试材料随机取5个块茎，用解剖刀从块茎的脐部到顶部将块茎分为均匀的两部分，再用切片器在每半块茎上切取1±0.2mm的薄片，将10个薄片放入50ml的三角瓶中，用10％的次氯酸钠漂洗，0.35％酸性品红染色，镜检，参照BYBD等(1982)的方法。

块茎上有雌虫为感病，无雌虫为抗病。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：营养钵内的培养基质为经高温高压灭菌的沙与土按照体积比为2:1比例混合的混合物。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：所用的营养钵直径为16cm×14cm，其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：扩繁马铃薯试管苗，待马铃薯试管苗培养20d左右，长到6-7片叶，将培养的株高和茎粗都一致的试管苗直接移栽到营养钵内。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：根结线虫完成一个生活周期具体指：根结线虫完成一个生活周期的时间大约为30天左右，但是其生活周期和温度密切相关。为了保证一个生活周期的完成，马铃薯接种南方根结线虫和爪哇根结线虫40天后收获，接种北方根结线虫45天收获，然后调查虫瘿指数、卵块数量和卵量；在试验中，为了保证准确评价块茎对根结线虫的抗感情况，将参试的马铃薯材料根据熟期进行分组，晚熟材料培养80天接种根结线虫，其它材料培养60天接种，并根据熟期选择合适的对照。

其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

采用下述试验验证本发明效果：

试验一：

一种高效筛选马铃薯对爪哇根结线虫的抗性，具体是按以下步骤完成的：

选取的试验材料：花525、早大白、东农303、威176选2、尤金、红参、克新17、抗疫1号、金红洋芋、凉薯14、青891、鲁引、闽薯1号、克新18、会-2、沙杂15、克新1号、Epoka、兴佳2号、中薯5号、克新13、Amsel、608Kennebec、白头翁、威05、贵州红、青薯3号、汪西和Spinnatisecta。

首先将无菌条件下长势良好的马铃薯试管苗移到温室。两天后用清水洗净根上的培养基，挑选整齐一致的试管苗移栽到准备好沙土的营养钵(16cm×14cm)中，每钵一株，5次重复，随机排列。移栽后视室外光强度进行遮荫，大约一周后顶部叶片展开，浇营养液，然后每周浇一次。温室温度控制在23-28℃范围内，保持16h光照，8h黑暗。培养60天后在植株周围用1mL移液枪头均匀扎3个孔，深度5cm左右，接种爪哇根结线虫5000卵/株。接种后一周内，浇水保持植株根部土壤湿润。之后正常水肥管理40天后收获，收获前剪掉地上部植株，留有3-3.5cm主茎，把根冲洗干净，将马铃薯植株和块茎全部放入拉链袋中带回试验室。植株根部用75mg/L的亮蓝染色，块茎用0.35％的品红染色，根据以上评价方法对植株的根和块茎评价。

试验重复一次，两次试验结果一致，最后确定试验中的29份材料全为感病材料，但感病程度有差异。此实验中鉴定的高感材料可以作为马铃薯对爪哇根结线虫抗感研究的感病对照材料。

本试验在9平方米的温室平台上完成了筛选，是用常规筛选方法占地面积的1/90，基质材料用量是常规方法的1/90，参试的29份试验材料长势良好，能有效的对植株和块茎进行评价。

试验二：

一种高效筛选马铃薯对南方根结线虫的抗性方法，具体是按以下步骤完成的：

首先将无污染长势良好的马铃薯试管苗移到温室，两天后用清水洗净根上的培养基，挑选整齐一致的试管苗移栽到装好灭菌沙土的营养钵(16cm×14cm)中，每钵一株，5次重复，随机排列。移栽后视室外光强度进行遮荫，大约一周后顶部叶片展开，浇营养液，然后每周浇一次。温室温度控制在23-28℃，保证16h光照，8h黑暗。接种前在距植株1cm周围用1mL移液枪头均匀扎3个孔，深度5cm，接种南方根结线虫5000卵/株。接种后一周内，适当增加浇水量，保持植株根部土壤湿润，之后正常水肥管理40天后收获。先剪掉地上部植株，把根和块茎用自来水冲洗干净，放入拉链袋中进行下一步试验。然后将植株根部用75mg/L亮蓝染色，调查卵块数量、卵量和虫瘿指数来评价植株抗性，用0.35％酸性品红进行块茎染色来评价块茎。

试验重复一次，两次试验结果一致，试验结果表明选取的29份材料对南方根结线虫都为感病材料，但感病程度有差异。此试验中鉴定的高感材料可以作为马铃薯对南方根结线虫抗感研究的感病对照材料。

本试验在9平方米的温室平台上完成了筛选，是用常规筛选方法占地面积的1/90，基质材料用量是常规方法的1/90，参试的29份试验材料长势良好，能有效的对植株和块茎进行评价。