越橘植物种质的超低温保存方法与流程

本发明涉及植物种质资源保存领域，具体地说，种越橘植物种质的超低温保存方法和超低温保存越橘植物种质恢复培养的方法。

背景技术：

越橘属于杜鹃花科( Ericaceae )越橘属( Vaccinium spp .)植物，为多年生落叶或常绿灌木或小灌木树种。全世界越橘属植物约有400个种，我国约有91个种、28个变种，分布于我国东北和西南地区。果实富含花色苷等抗氧化物质，具有改善视力、抗氧化、抗癌及延缓脑神经衰老等保健功能，被国际粮农组织列为人类五大健康食品之一，同时也被誉为“浆果之王”。

种质资源保存是越橘育种和保持遗传多样性的重要保证，培育高产、优质和高抗新品种离不开丰富的种质资源，因此开展越橘种质资源的保存具有重要的意义。

目前有关越橘种质资源的保存方法的研究较少，主要集中在原地栽培、迁地栽培以及种子库保存，但原地和迁地栽培管理和取材需要大量的人力、物力，且保存的种质资源占地面积大，易受到病虫害和自然条件的影响。随着生物技术的发展，基于利用植物组织培养技术对越橘种质资源进行保存的研究仅局限于在实验室中对研究材料的保存。一方面保存过程繁琐、费时费力，成本较高；另一方面，随着保存时间的延长和继代次数的增加，保存的材料易受到污染的干扰。

超低温保存技术是20世纪70年代在低温保存的基础上发展起来的一门新兴技术。超低温保存通常以液氮( -196℃)为冷源，生物材料保存在如此低温条件下，活细胞内的代谢活动几乎完全停止，因而可使生物材料在该温度下不会发生遗传性状的改变，且保存过程中细胞的活力及形态发生的全能性不受影响。因其具有操作简单，可保存时间长，占用空间小且不受病虫害的干扰等优点，是目前公认的长期而稳定的保存植物种质资源的理想方法。现已开发出多种超低温保存的方法，然而针对不同物种甚至对于同一物种的不同品种，其适宜的超低温保存方法及程序技术都有可能不同。目前有关利用超低温保存技术对越橘种质资源进行保存的研究尚未见报道。

技术实现要素：

本发明的目的是针对越橘现有保存技术中的不足，提供了越橘茎尖小滴玻璃化超低温保存的方法和超低温保存越橘植物种质恢复培养的方法。

越橘植物种质的超低温保存方法，它包括

1）炼苗：选取4周苗龄的组培苗，取0.4-0.6 cm带有顶芽的茎段接种到WPM培养基上4℃暗处理2—4周；

2）越橘茎尖剥取：在无菌条件下，在体视显微镜下剥取炼苗后的顶芽，茎尖长为1.5—2.0mm；

3）预培养：将剥取的茎尖接种于添加有0.3M蔗糖的WPM固体培养上，于组培室黑暗培养18—30h；

4）装载：将预培养后的离体茎尖转接于装载液中，于室温下装载处理20-40min；

5）玻璃化处理：将装载处理后的茎尖转接于PVS2溶液中，于0℃处理30-50min；

6）小液滴制作：将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上 ,并向每个茎尖滴加6μL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放9-11个茎尖；

7）超低温冷冻保存：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存；

步骤1) 所述的的炼苗时间为3周，步骤3)所述的预培养时间为24h时；

步骤4）中所述的装载液的组成为：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖，装载时间为30min；

步骤5）中所述的PVS2溶液的组成为：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖。处理时间为40min时；

超低温保存越橘植物种质恢复培养的方法

1） 卸载：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于卸载液中进行解冻和卸载；

2）恢复培养：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养。

超低温保存越橘植物种质恢复培养的方法，它包括的：

步骤1）所述的卸载液的组分为：WPM+1.2M蔗糖； 所述的卸载条件为：室温下卸载20min。

步骤2）所述的恢复培养基为WPM+0-0.5mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5.8； 恢复培养条件为：组培室黑暗培养 1d ,最后转至正常光照条件下进行培养。

本发明提供了越橘茎尖小滴玻璃化超低温保存的方法，是一种长期安全、稳定可靠、简单有效的保存越橘优良种质资源的方法，本发明以顶芽茎尖为超低温保存材料，一方面取材方便，另一方面由于茎尖含有茎尖分生组织，细胞再生能力较强，遗传稳定性高；超低温保存后越橘茎尖成活率高达100％，茎尖再生率为91.7％。

附图说明

图1 炼苗时间对越橘茎尖超低温保存的影响。

图2 加载时间对越橘茎尖超低温保存的影响。

图3 预培养时间对越橘茎尖超低温保存的影响。

图4 玻璃化处理时间对越橘茎尖超低温保存的影响。

图5 ZT浓度对越橘茎尖超低温保存的影响。

具体实施方式

实施例1 越橘茎尖小滴玻璃化法超低温保存技术及植株再生培养方法

实验方法具体操作如下：

1、练苗：选取4周苗龄的组培苗，取0.5 cm带有顶芽的茎段接种到WPM培养基上4℃暗处理3周;

2、越橘茎尖剥取：在无菌条件下，在体视显微镜下剥取炼苗后的顶芽，茎尖长为1.5—2.0mm;

3、预培养： 将剥取的茎尖接种于添加有0.3M蔗糖的WPM固体培养上，于组培室黑暗培养24h;

4、 装载：将预培养后的离体茎尖转接于组成为：WPM+2M甘油+1.0M蔗糖的装载液中，于室温下装载处理30min;

5、玻璃化处理：将装载处理后的茎尖转接于组成为：WPM+30％甘油+15％乙二醇+15％二甲亚砜+0.4M蔗糖的PVS2溶液中，于0℃处理40min;

6、小液滴制作：将PVS2处理后的茎尖转移到铝箔条上 ,并向每个茎尖滴加6μL PVS2溶液，使茎尖完全包裹于PVS2小液滴中，每个锡箔条上放10个茎尖;

7、超低温冷冻保存：将上述制作好的含有小液滴的锡箔条直接浸入液氮中进行冷冻，然后将冷冻后的锡箔条置于2ml冷冻离心管中，盖紧盖子后，投入液氮中保存;

8、卸载：将超低温冷冻保存的离体茎尖取出，放置于组分为：WPM+1.2M蔗糖的卸载液中进行解冻和卸载，室温下卸载20min;

9、恢复培养：将卸载处理后的离体茎尖用无菌滤纸吸干表面残留液，转接于恢复培养基中进行恢复培养；所述的恢复培养基为WPM+0.3mg/L ZT +3％蔗糖+0.7％琼脂，pH＝5 .8；其中恢复培养条件为：组培室黑暗培养 1d ,最后转至正常光照条件下进行培养。恢复培养7d后，成活的茎尖表现为绿色，而死亡的茎尖表现为褐色；培养30d后，成活的茎尖形成完整植株。

实施例2 炼苗时间和加载时间对越橘茎尖超低温保存的影响

操作步骤同实施例1，只改变炼苗时间，将炼苗时间设定为0、1、2、3、4、5周，加载时间为0、10、20、30、40min。恢复培养7d后统计越橘茎尖的成活率和30d统计再生情况。结果表明炼苗时间和加载时间对越橘茎尖保存后的成活率和再生率均有重要的影响。茎尖的成活率和再生率随着炼苗时间的变化呈现先升后降的趋势，如图1所示，随着加载时间的变化基本呈先升后降的趋势，如图2所示。炼苗时间为3周时，茎尖的成活和再生效果较好，加载时间为30min时，茎尖的成活和再生效果较好。

实施例3 预培养时间和玻璃化处理时间对越橘茎尖超低温保存的影响

操作步骤同实施例1，只改变预培养时间，将剥下的越橘茎尖接种含有0.3 M蔗糖的WPM固体培养基中，于组培室黑暗预培养0-48h，玻璃化处理时间设定为0、20、40、60、80min。恢复培养7d后统计越橘茎尖的成活率和30d统计再生情况。结果表明预培养时间和玻璃化处理时间对越橘茎尖保存后的成活率和再生率均有重要的影响。茎尖的成活率和再生率随着预培养时间的变化基本呈现先升后降的趋势，如图3所示，随玻璃化处理时间的变化呈先上升后下降再上升的趋势，如图4所示。预培养时间为24h时，茎尖的成活和再生效果较好，玻璃化处理时间为40min时，茎尖的成活和再生较好。

实施例4 再生培养基中不同浓度的ZT（玉米素）对越橘茎尖超低温保存的影响

操作步骤同实施例1，只改变ZT浓度，选取ZT浓度为0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mg/L。恢复培养7d后统计越橘茎尖的成活率和30d统计再生情况。结果表明ZT浓度对越橘茎尖保存后的成活率和再生率均有重要的影响。茎尖的成活率呈先降后升再降的趋势，再生率随着ZT浓度变化基本呈现先升后降的趋势，如图5所示，ZT浓度为0.3mg/L时，茎尖的成活和再生效果较好。