一种快速培育滩涂围垦土壤自然生物膜的方法及应用与流程

本发明涉及一种快速培育滩涂围垦土壤自然生物膜的方法及应用，尤其是涉及沿海滩涂重度盐分土壤表面原位、快速、大面积培养土壤自然生物膜的材料和方法，通过制备自然生物膜悬浮液，滩涂土壤原位接种富集自然生物膜，并覆膜加速扩大化培育土壤自然生物膜，从而有效控制滩涂围垦土壤返盐，提升土壤养分含量，为后期作物生长提供适宜生长环境，属于盐土生物改良技术领域。

背景技术：

我国沿海滩涂分布广、面积大，是巨大的潜在土地后备资源，极具拓展潜力。随着城市化的快速推进，滩涂围垦（marshy reclamation）成为我国沿海地区缓解耕地减少、保持耕地总量动态平衡的战略选择。建国以来，我国实施了一系列围填海工程，经历了50年代末期、70年代末期和90年代末期三次围垦高潮，其中江苏沿海滩涂开发战略规划到2020年，围填18万hm²海域滩涂，其中农业用地要占到总围填面积的60%。 而沿海新围垦土壤盐分浓度较高，且质地多数为泥沙性质，理化性质较为一致，养分含量低。因此，如何有效改良滩涂新围垦土壤，从而增加可利用耕地，对保障国家粮食安全具有重要的战略意义。

目前，沿海滩涂围垦后，种植水稻已成为沿海地区提高粮食总产量和改良盐碱土壤的重要手段之一。水稻种植可以利用大量淡水灌溉，加快土壤的水盐运动，达到快速淋洗土壤盐分，减少土壤蒸发，有效抑制土壤返盐，增加入渗淋盐，从而达到改良滩涂土壤的目的。然而，沿海新围垦滩涂土壤多数为泥沙，理化性质较为一致，养分固持能力差。因此，在滩涂围垦区域种植水稻过程中，过量施肥、超量施肥的现象普遍存在。大量施入化肥不仅增加了生产成本，而且过量的氮磷养分通过农田地表径流、农田排水和地下渗透进入附近水体，是引起邻近河流、湖泊等水体营养化的主要原因之一。

新近研究发现，自然生物膜广泛存在于稻田系统中，是一种生物和非生物物质共同组成的膜状聚合体，一般由藻类、细菌、真菌及小型原生动物及少量土壤组成。自然生物膜是在一定的水体环境条件下产生的微生物聚集体，主要由光合自养型生物主导，一般呈现绿色，普遍存在于河流、湖泊、湿地环境中的岩石、表层沉积物表面上，并由地球上不同种类的微生物组成。以往研究多集中于水体中的自然生物膜，对土壤表层生物膜的研究较匮乏。土壤自然生物膜可以看作一种先锋“物种”，能够在2%高盐浓度的土壤表层存活生长，并在表层形成一层膜状隔离层，有效抑制盐分向表层土壤的运移，从而为其他物种如植物的生存和繁殖提供适宜土壤环境。研究表明，自然生物膜是水土界面养分和盐分运移、转化及传输的必经之地，自然生物膜具有显著的固氮作用，对磷也具有较强的亲和力，其磷含量是周围水体和植物中磷含量的几百至几千倍，可以将氮磷等养分固持在生物膜体内。例如，自然生物膜可以通过吸收、截留、共沉降、吸附等方式有效的将水体中磷元素固定，并且可以释放碱性磷酸酶转化水体中有机磷，进而达到吸收利用有机磷的效果。研究发现，自然生物膜含磷量高达1-10 mg g^-1（DW，干重），是其他水生植物含磷量的几千倍。在全球磷矿资源短缺，磷元素价格逐年飙升的背景下，对土壤生物膜进行优化利用，提高磷肥利用率。同时，通过人工干预手段将生物膜翻耕入土，可以有效增加土壤有机质、磷等养分，达到有效改良滩涂围垦土壤性质，为我国滩涂农业可持续发展提供重要保障。

技术实现要素：

沿海新围垦滩涂土壤盐分高、养分低，本发明的目的为改良沿海滩涂新围垦土壤理化性质，一方面为沿海滩涂新围垦土壤改良技术提供新途径，设计一种高效、廉价、易实现、环境友好的滩涂土壤自然生物膜的富集及其扩大化生长方法；另一方面为沿海滩涂围垦开发及滩涂生态功能提升提供技术支持和理论参考，合理资源化利用土壤自然生物膜资源，从而有效控制表层土壤盐分含量，增加土壤养分含量，提升滩涂新围垦土壤肥力。

为达到上述目的，本方法是通过以下的技术方案来实现的：

一种快速培育沿海滩涂围垦土壤自然生物膜的方法，步骤如下：

（1）滩涂围垦土壤自然生物膜的快速富集；

（2）滩涂围垦土壤自然生物膜接种液或悬浮液的制备；

（3）滩涂围垦土壤的平整及配套设施的设计；

（4）滩涂围垦土壤自然生物膜的原位培育及扩大化培养；

（5）滩涂围垦土壤自然生物膜的后期管理与资源化处置。

进一步的，步骤（1）滩涂围垦土壤自然生物膜的富集包括原位富集和异位富集方法，两种富集方法相辅相成。在滩涂土壤表面无自然生物膜的情况下，采用异位富集办法，室内富集滩涂土壤自然生物膜；在滩涂土壤表层具有自然生物膜的情况下，利用原位富集方法，直接在野外进行土壤自然生物膜的富集。具体为：

在滩涂围垦土壤表面无自然生物膜的情况下，适宜采用异位富集办法，首先采取定量滩涂表层土壤（0-5 cm），按水土比2.5:1将土壤与水充分混匀后静止，然后将土壤溶液导入透明玻璃缸内（玻璃缸大小根据土壤悬浮液而定），将自然生物膜富集材料（腐熟秸秆）放入玻璃缸中进行滩涂土壤土著微生物的富集形成生物膜聚合体，玻璃缸放入光照培养箱内，控制光照时间14/10h，光照强度大于或等于12000 lux，温度30-35℃。为满足自然生物膜生长所需营养，定期加入适量培养液，具体配方如下：

表1土壤生物膜培养液配方

注：其他包括微量元素溶液、VB₁₂溶液、硫胺素溶液、和生物素溶液。微量元素溶液母液配方为： Na₂EDTA·2H₂O 4.36 g、FeCl₃·6H₂O 3.15 g、CuSO₄·5H₂O 2.5 g、ZnSO₄·7H₂O 22 g、CoCl₂·6H₂O 10 g、MnCl₂·4H₂O 180 g、Na₃VO₄ 18 g、Na₂MoO₄ ·2H₂O 6.3 g、蒸馏水1 L；VB₁₂溶液母液、硫胺素溶液母液和生物素溶液母液分别为27 mg VB₁₂、67 mg硫胺素和2400 mg生物素分别溶于200 mL HEPES缓冲液（2.4 g/200 mL dH₂O, pH7.8）中。

在野外滩涂土壤已经具有一定自然生物膜的情况下，利用原位富集方法，直接将土壤自然生物膜采集，进行土壤自然生物膜的快速富集。在田块附近，挖一个1 m³的水塘，用塑料膜覆上。光源是自养微生物生长繁殖必不可少的影响因子，因此选择在阳光充裕、温度适中（25℃以上）的条件下，将自然生物膜富集材料放入塘内进行自然生物膜的快速富集。

进一步的，所述的自然生物膜富集材料为腐熟的农业固废，农业固废主要包括作物秸秆、作物果实壳，优选作物秸秆；农业固废的腐熟过程为：取预处理好的固废放入密闭玻璃箱内，加入蒸馏水，加入腐熟剂，保持箱内湿度为80%以上，在大于30℃条件下腐熟7-15天，然后将腐熟的农业固废放在室外自然烘干1-2周，备用。腐熟后的秸秆更有利于微生物吸收利用，且表面粗糙度增加，能够促进土壤自然生物膜的富集及生长。

进一步的，步骤（2）滩涂土壤自然生物膜接种液或悬浮液的制备是将步骤（1）富集的生物膜聚合体加入蒸馏水中，充分搅拌混匀，制备成自然生物膜接种液或者悬浮液，以备接种所用。生物膜聚合体与蒸馏水的比例为1:10。具体的，按照每平米土壤约需5 g土壤自然生物膜（鲜重）原样进行配置。优选的，土壤生物膜悬浮液的具体制备方法如下：在进水渠内，围起一块封闭空间（根据生物量和水量而定），用塑料膜覆上，加入富集好的土壤生物膜和水，水与生物膜质量比为10:1，用木棒或其他工具将水与生物膜充分搅拌均匀，制备成土壤生物膜悬浮液，备用。进一步的，步骤（3）滩涂围垦土壤的平整是利用机械化工具（挖掘机等）将围垦土地进行翻耕和推平等工程化操作，利用旋耕机旋平土壤，要求土壤的高低差不能高于5cm，田间不能有低洼、凸起等。围垦土壤周围的配套设施主要包括统一化管理的进水和排水渠道，进水渠宽大于100 cm，排水渠大于200 cm，长度根据田块面积而定，围垦田块面积适宜在3-5亩之间，每块田设置一个进水排水管道，用直径40-50 cm的PVC管制成L形管，田埂高度在60 cm以上，田间每隔200 cm设置一个排水沟，沟深10 cm，宽20 cm，如附图1所示。

进一步的，步骤（4）所述的滩涂土壤自然生物膜的原位培育及扩大化培养，是将制备好的自然生物膜悬浮液均匀撒在土壤表层，在合适的野外环境条件下进行富集培养，要求光照充足，田间水深1-5 cm。为增加光照和温度，避免高强度降雨对自然生物膜的影响，可在土壤上方50 cm处覆盖一层透明塑料薄膜。待土壤生物膜富集成功后（土壤表面可见明显绿色膜），进行土壤生物膜的扩大化培育，将有机肥和秸秆粉末充分混匀后撒入土壤表面，再加入适量无机肥。滩涂土壤自然生物膜扩大化培养需要的养分条件如下：有机肥15公斤/亩，秸秆粉末25公斤/亩以及氮磷钾复合肥10公斤/亩。一般光线充足，温度适宜的情况下，生物膜的扩大化培育需要时间为15-30 d，土壤表层即可形成一层厚度约为0.1 cm的生物膜，此时即可翻耕再次培育土壤生物膜。

本发明的目的之二是提供上述方法在改良沿海滩涂新围垦土壤理化性质方面的应用。

富集培养好的自然生物膜可以充当“生物肥料”，研究表明自然生物膜可以高效地将有机磷转化为无机磷，还可以通过吸附、吸收以及储存磷元素，同时还能固定大气中的氮元素，其本身也是多种微生物有机体，翻耕入土，可以有效增加土壤肥力。一般条件下，土壤生物膜生长周期短（约15 d），可以快速多次培肥。

本发明方法的有益效果在于：

（1）该方法具有较强的灵活性，可以依据滩涂围垦规模的大小，配置相应面积的土壤生物膜，并可以反复培育，快速增加土壤有机质，为滩涂土壤肥力的提升打下坚实基础。同时，自然生物膜覆盖后可以有效抑制土壤返盐，即可以控制土壤表层盐分含量，又增加土壤肥力。本方法为资源化自然生物资源，为充分合理利用微生物复合体提供了新的路径，为我国滩涂开发及土壤改良提供有力的技术基础。

（2）本方法采用的生物处理方法，有效地降低了其因不当利用造成的环境风险的可能，解决了传统化学处理使用的化学试剂费用较高、操作不便、具有环境风险等缺陷，该操作方法简单易行，环境友好，改善土壤效果突出。同时，将农业秸秆作为生物膜富集材料投入土壤，通过改性农业秸秆，使其表面的物化性质更有利于微生物富集，从而实现高效大量培养滩涂土壤生物膜的同时，也为循环利用农业固废提供新的途径。

（3）该方法具有较强的实用性，且成本低廉，可操作性强。其充分利用微生物的“先锋”物种与高耐盐特征，在土壤表面生长繁殖，从而达到改良滩涂土壤的目的。同时，土壤生物膜对低温的耐性较强，只要光照充足就可以富集生长，因此可以在冬季作物停止生长时，对土壤进行生物膜生长培肥，提升地力。

附图说明

图1为围垦土壤周围的配套设施示意图。其中：1.围垦滩涂土壤，2.进水渠道，3.排水渠道，4.排水沟，5.进水口，6.排水口。

图2为滩涂土壤上形成的自然生物膜形态，组成和结构特征。

图3为不同基质下土壤生物膜生物量的变化。

图4为土壤自然生物膜生长后，土壤表层有机质含量的变化。

图5为滩涂土壤自然生物膜富集后，土壤表层含盐量（电导率）变化。

图6为已经具有一定自然生物膜的野外滩涂土壤。

具体实施方式

以下结合附图和具体实验方案对本发明作具体的介绍。

实施例1

一种快速富集和扩大化培育土壤自然生物膜的技术，尤其是涉及沿海滩涂重度盐分土壤表面原位、快速、大面积培养土壤自然生物膜的方法和材料，通过制备自然生物膜悬浮液，滩涂土壤原位接种富集自然生物膜，并覆膜加速扩大化培育土壤自然生物膜，从而有效控制滩涂围垦土壤返盐，提升土壤养分含量，为后期作物生长提高适宜生长环境。为验证该方法的可行性，设立以下实验，具体步骤为：

（1）典型沿海滩涂土壤的采集：在江苏盐城市射阳县滩涂围垦地区，采集500公斤0-20 cm滩涂土壤，土壤盐分含量在0.15%以上，将土壤运回实验室阴干过筛，剔除杂质，备用。

（2）土壤自然生物膜的富集：按水土比2.5:1将取回土壤与水充分混匀后静止，然后将土壤溶液导入透明玻璃缸内（长30 cm，宽40 cm，高30 cm），将自然生物膜富集材料（腐熟秸秆）放入玻璃缸中进行滩涂土壤土著微生物的富集。腐熟秸秆的制作是将定量农业秸秆（水稻、小麦等）加入秸秆腐熟剂（2kg/亩，1000公斤秸秆，沃宝生物科技有限公司），保持箱内湿度为80%以上，对其进行一定时间的腐熟（7-15 d）。玻璃缸放入光照培养箱内，控制光照时间14/10h，光照强度大于或等于12000 lux，温度30-35℃。

（3）土壤自然生物膜悬浮液的制备：按照每平米土壤约需5 g土壤自然生物膜（鲜重）原样进行配置。水与生物膜质量比为10:1，将水与生物膜充分搅拌均匀，制备成土壤生物膜悬浮液，备用。

（4）滩涂土壤自然生物膜的生长及其扩大化培育：将1Kg滩涂土壤装入塑料盆（直径20 cm，高10 cm），加水浸透，使土壤充分湿润。然后，将制备好的土壤生物膜悬浮液均匀施加在土壤表层，加水保持水深1-2 cm。为研究不同基质对土壤生物膜扩大化效果，设置四组处理：土壤基质（LP），土壤+秸秆基质（WP，3%），土壤+生物炭基质（RP，3%）。为满足土壤自然生物膜生长所需营养，定期加入适量营养液，营养液配方见表1。

（5）滩涂土壤及自然生物膜指标测定：待土壤生物膜生长成熟（约20 d），取适量土壤及生物膜进行以下指标测定：土壤表层电导率，土壤表层有机质含量，土壤生物膜形态及其生物量。

图2为富集材料上形成的滩涂自然生物膜形态，组成和结构特征。由图可以看出，本方法所富集的滩涂自然生物膜物种多样性较高，包括藻类（图2c-f，如绿球藻，Chlorococcum sp.，双头针杆藻Synedra ulna Kütz.等）、细菌（图2g）、原生动物（图2h-j）等，其中藻类是主导物种，这些光合藻类错综盘杂的交织在一起形成光合生物膜的基本结构，为其他微生物提供了 “栖息地”。以上所述特征证明了光合生物膜是一个复杂的微生物聚合体，以藻类为基质，各种微生物共同生存的一个微生态系统，这也为其有效改良滩涂土壤提供了有利的条件。

图3为不同基质下土壤生物膜生物量的变化，可以看出，纯土壤基质培养生物膜生物量可达到约120 g m^-2。与纯土壤相比，施加秸秆有利于土壤生物膜的生长富集，达到约160 g m^-2。而施加生物炭则抑制土壤生物膜的生长富集，土壤生物膜生物量不到40 g m^-2。

图4为土壤自然生物膜生长后，土壤表层有机质含量的变化，可以看出土壤生物膜生长后，土壤有机质含量增加，在土壤基质、秸秆基质、生物炭基质处理下分别为6、10及32 g Kg^-1，对照为5 g Kg^-1。其中，生物炭施加处理有机质增加幅度最大，这是因为生物炭本身就是一种有机质，施加到土壤后导致土壤有机质增加显著。

图5为滩涂土壤自然生物膜富集后，土壤表层含盐量（电导率）变化，可以看出与对照相比，生长自然生物膜60 d后，土壤表层电导率在3 md/cm左右，显著低于对照（6 md/cm左右）。这一定程度上说明了土壤生物膜的富集和覆盖显著控制了盐分在土壤表层的积累。

实施例2

本实施例选取已经具有一定自然生物膜的野外滩涂土壤如图6，采用原位富集方法，直接在野外进行土壤自然生物膜的富集。

（1）滩涂土壤自然生物膜的原位富集：在田块附近，挖一个1 m³的水塘，用塑料膜覆上。选择在阳光充裕、温度适中（25℃以上）的条件下，将腐熟秸秆放入塘内进行自然生物膜的快速富集。

（2）滩涂土壤自然生物膜悬浮液的制备：在进水渠内，围起一块封闭空间，用塑料膜覆上，加入富集好的土壤生物膜和水，水与生物膜质量比为10:1，用木棒将水与生物膜充分搅拌均匀，制备成土壤生物膜悬浮液，备用。

（3）滩涂土壤的平整及配套设施的设计：滩涂围垦土壤的平整是利用挖掘机将围垦土地进行翻耕和推平等工程化操作，利用旋耕机旋平土壤，围垦土壤周围的配套设施主要包括统一化管理的进水和排水渠道，进水渠宽大于100 cm，排水渠大于200 cm，长度根据田块面积而定，围垦田块面积适宜在3-5亩之间，每块田设置一个进水排水管道，用直径40-50 cm的PVC管制成L形管，田埂高度在60 cm以上，田间每隔200 cm设置一个排水沟，沟深10 cm，宽20 cm，如附图1所示。

（4）滩涂土壤自然生物膜的原位培育及扩大化培养：是将制备好的自然生物膜悬浮液均匀撒在土壤表层，在野外环境条件下进行富集培养，要求光照充足，田间水深1-5 cm。为增加光照和温度，避免高强度降雨对自然生物膜的影响，在土壤上方50 cm处覆盖一层透明塑料薄膜。待土壤生物膜富集成功后（土壤表面可见明显绿色膜），进行土壤生物膜的扩大化培育，将有机肥和秸秆粉末充分混匀后撒入土壤表面，再加入适量无机肥。滩涂土壤自然生物膜扩大化培养需要的养分条件如下：有机肥15公斤/亩，秸秆粉末25公斤/亩以及氮磷钾复合肥10公斤/亩。一般光线充足，温度适宜的情况下，生物膜的扩大化培育需要时间为15-30 d，土壤表层即可形成一层厚度约为0.1 cm的生物膜，此时即可翻耕再次培育土壤生物膜。

该方法具有较强的实用性，且成本低廉，可操作性强。其充分利用微生物的“先锋”物种与高耐盐特征，在土壤表面生长繁殖，从而达到改良滩涂土壤的目的。同时，土壤生物膜对低温的耐性较强，只要光照充足就可以富集生长，因此可以在冬季作物停止生长时，对土壤进行生物膜生长培肥，提升地力。

上述实施例不以任何形式限制本发明，凡采用等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。