本发明涉及卵巢组织冷冻保存，更详细地说，本发明涉及宠物卵巢组织冻存与复苏试剂以及宠物卵巢组织冻存与复苏方法。
背景技术：
宠物(主要指作为伴侣动物的狗和猫)能够陪伴人类，缓解日常生活中的压力，愉悦心情，促进人类健康，成为家庭中的一员。随着我国经济的发展、老龄化程度的加重，对宠物的需求越来越大。宠物数量增加的同时，宠物食品、宠物用品、宠物培训等产业得到了蓬勃的发展。宠物健康领域并没有受到足够的关注，也尚未形成规范。相比人类健康市场，宠物健康市场有很大的空间尚待挖掘。关爱宠物，关注宠物健康。
国内外一般推荐宠物在6到8月龄时进行绝育或去势手术。主要优点包括避免很多与生殖激素相关疾病的发生，节省宠物主人在宠物生殖方面的时间花费，控制群体数量。
宠物的绝育是指雌性宠物的卵巢切除术或卵巢子宫切除术。对于宠物个体而言，绝育手术可以降低雌性宠物患乳腺癌的风险，消除子宫积脓的风险，避免卵巢囊肿、难产等疾病的发生。
然而，切除卵巢之后，目前都将卵巢组织丢弃，宠物不仅丧失了生殖能力，体内的激素水平也遭到了破坏。长期的激素水平失调会造成宠物精神状态萎靡、行为异常，随着年龄的增长往往导致肥胖等代谢疾病。宠物的运动系统发育也会受到影响，关节韧带发育不良，骨质疏松等发病风险增高。
目前的处理方式无法给宠物二次选择的机会，绝育就意味着丧失生殖力与破坏激素水平。相比人类健康领域，卵巢冻存和自体移植技术在不断发展。理想的方式是通过冻存技术保存生殖力，在必要的时候可选择性的进行自体移植，恢复生殖力和激素水平。宠物健康领域此类技术尚没有得到开发和应用。
技术实现要素：
发明要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种快速高效的宠物卵巢组织冻存与复苏试剂以及冻存与复苏方法。
用于解决上述技术问题的方案
本发明包含宠物卵巢组织冻存试剂和宠物卵巢组织复苏试剂，成分明确稳定，保质期长，制备后可直接应用于宠物卵巢组织的冻存和复苏，使用方便，组织复苏活性高。本发明依托组织玻璃化冻存(快速冻存，直接从常温进入液氮)理论技术，冻存试剂中联合使用两种低温保护剂二甲基亚砜(DMSO)、丙二醇(PROH)，提高玻璃化效率的同时减低保护剂对细胞的毒性，首次将枸杞多糖(LBP)用于组织玻璃化冻存，在宠物卵巢组织冻存中效果远优于传统的蔗糖(SUC)；针对卵巢组织特性，复苏试剂中首次添加维生素E(VE)和血管内皮生长因子(VEGF)，较大程度的提高了复苏过程中的氧化应激对细胞造成的损伤。
本发明的第一方面，提供了宠物卵巢组织冻存试剂组，
所述宠物卵巢组织冻存试剂组包括：
(1)冻存试剂1：枸杞多糖2～7W/V％，二甲基亚砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培养基80～90V/V％；
(2)冻存试剂2：枸杞多糖8～10W/V％，二甲基亚砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培养基70～80V/V％；
(3)冻存试剂3：枸杞多糖15～20W/V％，二甲基亚砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培养基70～80V/V％。
较优的，所述冻存试剂组包括：
(1)冻存试剂1：枸杞多糖2～7W/V％，二甲基亚砜6～14V/V％，丙二醇2～7V/V％，MEM培养基80～90V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(2)冻存试剂2：枸杞多糖8～10W/V％，二甲基亚砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培养基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(3)冻存试剂3：枸杞多糖15～20W/V％，二甲基亚砜6～20V/V％，丙二醇5～15V/V％，MEM培养基70～80V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％。
较优的，所述冻存试剂组包括：
(1)冻存试剂1：枸杞多糖6W/V％，二甲基亚砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培养基85V/V％；
(2)冻存试剂2：枸杞多糖9W/V％，二甲基亚砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培养基75V/V％；
(3)冻存试剂3：枸杞多糖18W/V％，二甲基亚砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培养基75V/V％。
更优的，所述冻存试剂组包括：
(1)冻存试剂1：枸杞多糖6W/V％，二甲基亚砜10V/V％，丙二醇5V/V％，MEM培养基85V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(2)冻存试剂2：枸杞多糖9W/V％，二甲基亚砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培养基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(3)冻存试剂3：枸杞多糖18W/V％，二甲基亚砜12V/V％，丙二醇13V/V％，MEM培养基75V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％。
本发明的第二方面，提供了宠物卵巢组织复苏试剂组，所述复苏试剂组包括：
(1)复苏试剂1：枸杞多糖35～55W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％；
(2)复苏试剂2：枸杞多糖25～45W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％；
(3)复苏试剂3：枸杞多糖15～35W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％；
(4)复苏试剂4：枸杞多糖5～25W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％，血管内皮生长因子1～10μg/L。
较优的，所述复苏试剂组包括：
(1)复苏试剂1：枸杞多糖35～55W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(2)复苏试剂2：枸杞多糖25～45W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％，聚乙烯吡咯烷酮0.1～0.5W/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(3)复苏试剂3：枸杞多糖15～35W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％；
(4)复苏试剂4：枸杞多糖5～25W/V％，维生素E 0.05～0.35V/V％，MEM培养基99.65～99.95V/V％，葡萄糖1～10W/V％，血管内皮生长因子1～10μg/L。
较优的，所述复苏试剂组包括：
(1)复苏试剂1：枸杞多糖40W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％；
(2)复苏试剂2：枸杞多糖30W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％；
(3)复苏试剂3：枸杞多糖20W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％；
(4)复苏试剂4：枸杞多糖10W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％，血管内皮生长因子1μg/L。
更优的，所述复苏试剂组包括：
(1)复苏试剂1：枸杞多糖40W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(2)复苏试剂2：枸杞多糖30W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％，聚乙烯吡咯烷酮0.3W/V％，葡萄糖5W/V％；
(3)复苏试剂3：枸杞多糖20W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％，葡萄糖5W/V％；
(4)复苏试剂4：枸杞多糖10W/V％，维生素E 0.2V/V％，MEM培养基99.8％，葡萄糖5W/V％，血管内皮生长因子1μg/L。
本发明的第三个方面是提供一种宠物卵巢组织冻存复苏试剂套装，包括上述第一方面的冻存试剂组和第二方面的复苏试剂组。
本发明的第四个方面是提供一种宠物卵巢组织冻存方法，包括：将离体宠物卵巢组织依次浸入上述第一方面的冻存试剂1、冻存试剂2、冻存试剂3中保持5分钟以上之后，液氮存储。
本发明的第五个方面是提供一种宠物卵巢组织复苏方法，包括：将经冻存的离体宠物卵巢组织依次浸入上述第二方面的复苏试剂1、复苏试剂2中，在37±2℃各保持2分钟以上，之后，移入上述第二方面的复苏试剂3、复苏试剂4中，室温下各保持10分钟以上。
发明效果
本发明的冻存复苏试剂组可以使宠物卵巢组织短期(约一周)冻存、复苏的活率达到90％以上，长期(约三年)冻存、复苏的活率达到70％以上，能够很好的冷冻保存生殖力。发明人首次将枸杞多糖引入冻存领域，首次将维生素E引入复苏试剂，最后一步的复苏试剂中首次加入微量的血管内皮生长因子，三种物质协同作用，取得了针对宠物卵巢组织冻存、复苏的非常显著的协同效果。本发明试剂成分明确，制备方便，利于大规模生产。
一直以来，组织玻璃化冻存领域研究重点在于针对不同的细胞和组织，寻找毒性较小的玻璃化溶液配比方案及提高降、复温速率的方法。本发明中通过联用两种细胞保护剂二甲基亚砜和丙二醇，在保证效果的同时控制细胞保护剂对细胞造成的毒性。
本发明冻存试剂组包含3种试剂，复苏试剂组包含4种试剂，梯度化升高和降低枸杞多糖的浓度较一步法效果优。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1-5：宠物卵巢组织冻存试剂的制备
(1)以100ml冻存试剂1的制备为例：分别按照表1所示的量，量取二甲基亚砜(购自SIGMA)、丙二醇(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、聚乙烯吡咯烷酮((简称PVP)购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用；
(2)以100ml冻存试剂2制备的为例：分别按照表1所示的量，量取二甲基亚砜(购自SIGMA)、丙二醇(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用；
(3)以100ml冻存试剂3制备为例：分别按照表1所示的量，量取二甲基亚砜(购自SIGMA)、丙二醇(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用。
本发明的宠物睾丸组织冻存试剂组包括三种试剂，其中的枸杞多糖浓度依次增大。
表1：冻存试剂的制备
实施例6-10：宠物卵巢组织复苏试剂的制备
(1)以100ml复苏试剂1的制备为例：分别按照表2所示的量，量取维生素E(油状液体，纯度标≥98％)(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用；
(2)以100ml复苏试剂2的制备为例：分别按照表2所示的量，量取维生素E(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、聚乙烯吡咯烷酮(购自SIGMA)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用；
(3)以100ml复苏试剂3的制备为例：分别按照表2所示的量，量取维生素E(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、葡萄糖(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用；
(4)以100ml复苏试剂4的制备为例：分别按照表2所示的量，量取维生素E(购自SIGMA)、MEM培养基(购自GIBCO)放入250ml蓝口瓶(购自蜀牛)，轻摇混匀，称取枸杞多糖(购自斯诺特生物)、葡萄糖(购自SIGMA)、血管内皮生长因子(购自SIGMA)加入上述瓶中，摇晃混匀。待固体全部溶解后用0.22μm滤器(购自MILLIPORE)过滤除菌，过滤至经过高压灭菌的100ml蓝口瓶(购自蜀牛)，4℃保存备用。
本发明的宠物卵巢组织复苏试剂组包括四种试剂，其中的枸杞多糖浓度依次降低。
表2：复苏试剂的制备
对照例
对照A组：除了在复苏试剂中去除维生素E和血管内皮生长因子外，其他条件与实施例5和实施例10相同。
对照B组：在实验对照A组基础上将枸杞多糖换成等量的蔗糖，其他条件不变。
对照C组：除了将冻存和复苏试剂中的枸杞多糖换成等量的蔗糖外，其他条件与实施例5和实施例10相同。
传统对照组，采用文献试剂和方法冻存，简述如下：冻存试剂中包括2mol/L二甲基亚砜、2mol/L丙二醇、不同浓度的蔗糖，复苏试剂中包含0.5～0.125mol/L蔗糖，具体操作步骤见文献中的玻璃化冻存方案(李宇彬,周灿权,杨国奋,等.人卵巢组织两种超低温冻存方法的研究[J].中山大学学报医学科学版,2006,27(6):704-708.)。
表3：
效果试验：
1.宠物卵巢组织冻存、复苏试剂的短期效果验证
(1)卵巢组织的获取：在宠物主、宠物医生知情同意的情况下，分别收集6～8月龄宠物狗进行绝育手术时切除下来的卵巢组织。20分钟内，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的组织片，浸泡在含有10％血清(购自GIBCO)的DMEM培养基(购自GIBCO)中，置于冰上。
(2)卵巢组织的切片：用手术刀片将卵巢组织片进一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，长度控制在5～10mm，宽度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分钟内完成。
预留部分组织切片不进行后续的冻存复苏操作，用作为后续对照试验的未冻存组织切片(以下简称“新鲜对照组”)。
(3)卵巢组织的冻存与复苏：随机取出(2)中的卵巢组织切片3片，使用无菌纱布吸干净多余水分。将组织切片浸入实施例1的冻存试剂1中，常温10分钟。组织切片取出后，继续使用无菌纱布吸干净多余水分，移入冻存试剂2中，常温20分钟。同样的操作移入冻存试剂3中，常温30分钟。取出组织切片，放置于金属铜网条上，使用无菌纱布吸干净多余水分。立即投入事先准备好的无菌液氮中，5分钟后即可将组织切片连同铜网条转入事先预冷的冻存管中，液氮存储。1周后，准备复苏冻存组织，37℃水浴箱预热实施例6的复苏试剂1、复苏试剂2。液氮中取出组织切片连同铜网条迅速置入复苏试剂1中，轻摇，37℃2分钟，可见组织切片从铜网条上脱落，将组织切片移入复苏试剂2中，37℃5分钟。然后依次将组织切片移入复苏试剂3、复苏试剂4中，室温各10分钟(简称为实施例1+6)。
同样的条件下进行实施例2+7、实施例3+8、实施例4+9、实施例5+10、对照A组、对照B组、对照C组、传统对照组的实验。
(4)组织培养上清雌二醇检测及正常原始卵泡计数：将(3)中各实施例、对照组以及(2)中的新鲜对照组的组织切片分别置入细胞培养6孔板1个孔中培养，2ml 10％DMEM培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养48小时。收取500ul上清，使用雌二醇(E2)检测试剂盒(购自IMMUNOCLONE)检测卵巢组织雌二醇分泌量。组织切片用常规石蜡包埋后制作HE染色切片，显微镜下统计100个原始卵泡，统计正常原始卵泡数量。各实验分别重复三次，取平均值作为实验结果，实验结果如表4所示，表4反映冻存1周后复苏组织雌二醇分泌功能情况以及短期冻存复苏正常原始卵泡占比情况。无论上清雌二醇分泌情况还是正常原始卵泡占比，实施例冻存复苏后的结果都接近新鲜对照组，并且各实施例结果优于对照A组、对照B组、对照C组以及传统对照组，说明本发明的枸杞多糖、维生素E、血管内皮生长因子协同作用，对冻存复苏活率的提高具有显著效果。
表4：冻存、复苏试剂的短期效果
注：实施例1+6表示实施例1的冻存试剂+实施例6的复苏试剂组合使用，下同。
此外，本发明采用同样的方法收集6～8月龄宠物猫进行绝育手术时切除下来的卵巢组织，进行了上述(1)-(4)的冻存和复苏试验，冷冻试剂为实施例5，复苏试剂为实施例10，结果显示雌二醇分泌量为58pmol/L，正常原始卵泡百分比为92％。
2.宠物卵巢组织冻存、复苏试剂的长期效果验证
(1)卵巢组织的获取：在宠物主、宠物医生知情同意的情况下，分别收集6～8月龄宠物狗进行绝育手术时切除下来的卵巢组织。20分钟内，剔除多余的脂肪、筋膜，修剪成1～2cm厚度的组织片，浸泡在含有10％血清(购自GIBCO)的DMEM培养基(购自GIBCO)中，置于冰上。
(2)卵巢组织的切片：用手术刀片将卵巢组织片进一步修剪，厚度控制在0.8～1.2mm，长度控制在5～10mm，宽度控制在2～5mm。修剪操作全程在10％血清DMEM中冰上操作，于30分钟内完成。
(3)卵巢组织的冻存与复苏：取出(2)中的卵巢组织切片18片，随机分成6组，每组3片，使用无菌纱布吸干净多余水分。取5组组织切片分别浸入5组实施例的冻存试剂1中，常温10分钟。组织切片取出后，继续使用无菌纱布吸干净多余水分，移入冻存试剂2中，常温20分钟。同样的操作移入冻存试剂3中，常温30分钟。取出组织切片，放置于金属铜网条上，使用无菌纱布吸干净多余水分。立即投入事先准备好的无菌液氮中，5分钟后即可将组织切片连同铜网条转入事先预冷的冻存管中，液氮存储。设置不同的时间点复苏组织，时间点设置为0.5年、1年、2年、3年。准备复苏冻存组织时，37℃水浴箱预热复苏试剂1、复苏试剂2。液氮中取出组织片连同铜网条迅速置入复苏试剂1中，轻摇，37℃2分钟，可见组织切片从铜网条上脱落，将组织片切移入复苏试剂2中，37℃5分钟。然后依次将组织切片移入复苏试剂3、复苏试剂4中，室温各10分钟。
取1组组织切片进行传统对照组的试验，采用文献试剂和方法冻存，简述如下：冻存试剂中包括2mol/L二甲基亚砜、2mol/L丙二醇、不同浓度的蔗糖，复苏试剂中包含0.5～0.125mo l/L蔗糖，具体操作步骤见文献中的玻璃化冻存方案(李宇彬,周灿权,杨国奋,等.人卵巢组织两种超低温冻存方法的研究[J].中山大学学报医学科学版,2006,27(6):704-708.)。
(4)组织培养上清雌二醇检测及正常原始卵泡计数：将各实施例和传统对照组的组织切片分别置入细胞培养6孔板1个孔中培养，2ml 10％DMEM培养基，37℃，5％CO2细胞培养箱中培养48小时。收取500u l上清，使用雌二醇(E2)检测试剂盒(购自IMMUNOCLONE)检测卵巢组织雌二醇分泌量。组织片用常规石蜡包埋后制作HE染色切片，显微镜下统计100个原始卵泡，统计正常原始卵泡数量。每个时间点随机设置3个组织样品。实验结果如表5所示，表5反映冻存0.5、1、2、3年后复苏组织雌二醇分泌功能情况以及长期冻存复苏正常原始卵泡占比情况。由表5可知，本发明实施例组效果在长期保存条件下远优于传统对照组，并且各组冻存效果在1年左右稍有变化后趋于稳定，说明玻璃化冻存技术的优劣主要体现在组织出入液氮时的保护，组织存储于液氮后保存效果较为稳定。
表5：冻存、复苏试剂的长期效果
以上已对本发明创造的较佳实施例进行了具体说明，但本发明创造并不限于所述实施例，熟悉本领域的技术人员在不违背本发明创造精神的前提下还可作出种种的等同的变型或替换，这些等同的变型或替换均包含在本申请权利要求所限定的范围内。