二氧化氯消毒培养基用于马铃薯幼苗快速繁殖或试管薯诱导的方法与流程

本发明涉及一种植物组织培养技术领域，更确切地说涉及一种二氧化氯消毒培养基用于马铃薯幼苗快速繁殖或试管薯诱导的新方法。

背景技术：

马铃薯是双子叶植物茄科茄属一种具有粮食、蔬菜、饲料多用型的作物，对生境适应性较为广泛，适于其他主要作物难以生长的环境条件，在全球155个国家都有种植。2016年初，我国农业部发布《关于推进马铃薯产业开发的指导意见》，提出到2020年，马铃薯种植面积扩大到1亿亩以上，适宜主食加工的品种种植比例达到30%，主食消费占马铃薯总消费量的30%。马铃薯主粮化是我国在主粮作物增产空间小、生态环境压力增大、消费者营养不均衡等背景下实施的保障国家粮食安全的重大战略。然而，我国马铃薯生产水平较低，平均亩产不及1000 kg，而发达国家的亩产则超过2500 kg。马铃薯生产中的主要限制因素是其在长期营养生长过程中感染病毒导致的种质资源退化，已记载超过30种马铃薯病毒。在长期的营养生长过程中，马铃薯遭遇了大量病毒的侵袭，导致产量和品质大幅降低。病毒检测发现，所有测试品种都受到至少一种病毒的侵袭。对此，科学家开展了大量卓有成效的脱毒研究，以恢复其产量和品质。利用马铃薯茎尖组织培养获得脱毒试管苗，进而诱导试管薯，是获得脱毒马铃薯原原种基础环节。通过脱毒培养，马铃薯的品质得以大幅提升，产量达到3000kg，为脱毒前的3倍。然而，由于组培过程导致脱毒薯原原种成本极高，加之我国农民自留种的习惯，我国马铃薯实际生产中约80%为带毒种源，使得平均产量大幅降低。因此，降低脱毒脱毒薯原原种生产成本将有助于大幅提高我国马铃薯产量，促进其主粮化进程。

利用细胞全能性，选取尚未感染病毒的茎尖分生组织为外植体进行离体培养获得再生，可有效去除病毒，提高马铃薯生产水平。在马铃薯无菌苗脱毒培养过程中，培养基高温高压灭菌能耗费占整个培养过程成本比例极高。因此，发展低成本的培养基灭菌方法替代传统的高温高压灭菌法对普及推广马铃薯脱毒苗至关重要。

自20世纪30年代美国植物生理学家White建立第一个已知成分的人工合成培养基以来，植物组织培养技术迅速发展并广泛应用于植物快速繁殖、基因功能验证及分子育种等领域。组织培养技术是利用细胞的全能性，将细胞或器官培育成完整植株的过程。在离体条件下，细胞或器官的培养必须在无菌环境下进行。因此，培养基必须经过严格的消毒以保持无菌环境。目前，培养基灭菌主要通过高温高压法（压力102.9 kPa，温度121～126℃，维持20～30分钟）完成。高温高压灭菌消耗电能占整个培养基配制成本（包括试剂、耗能和人员费）的50%左右，与马铃薯无菌苗脱毒培养成本核算结果一致，平均每瓶培养基（33 ml）消耗电能费用约为0.083元。同时，该灭菌方法对培养基容器材质选择性较强，并且经过几次灭菌后容器透光度会显著降低，影响培养效果，而透光性较好的PVC-聚氯乙烯等材质通常不能进行高温高压灭菌，需采用环氧乙烷灭菌，一次性用后扔弃，致使价格昂贵且造成巨大浪费。此外，在不具备高温高压灭菌器等仪器设备及条件的基层机构，尤其是大规模组织培养脱毒领域，难以实现无菌培养基的配制与操作。因此，探索其他简易灭菌方法替代高温高压灭菌法成为植物组织培养领域的研究热点之一。科学家探索了多种消毒剂在植物培养基灭菌方面的应用。国内外科学家考察了植物精油和二氯异氰尿酸钠等试剂对植物组织培养基的灭菌效果。但都存在价格昂贵，灭菌后消毒剂物质残留的问题，且缺乏系统研究。

二氧化氯具有较强氧化性，是一种新型的对环境无害的消毒剂，在使用过程中不会产生毒性物质。二氧化氯已被广泛应用于生产生活密切相关的诸多领域。我们课题组在前期研究中评价了液体二氧化氯在植物外植体消毒上的应用，发现二氧化氯能有效杀灭植物外植体表面的微生物，但灭菌处理后外植体活性与植物内源酚类物质含量有关。进而，我们测试了二氧化氯消毒植物组织培养基并成功应用于部分植物的组织培养实践（CN106171970A）。这提示我们将二氧化氯培养基用于脱毒马铃薯原原种生产有很大潜能，助于发展节能、环保、简易的马铃薯培养基配制方法，加速脱毒马铃薯在我国的推广种植，促进马铃薯的主粮化发展。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足提供一种二氧化氯消毒培养基用于马铃薯幼苗快速繁殖或试管薯诱导的方法，简化培养基消毒程序、延长消毒时间并大幅降低能耗费用。

本发明所采用的技术方案是：在室温下，使用液体二氧化氯作为消毒剂，快速获得无菌的脱毒马铃薯幼苗快速繁殖培养基或脱毒马铃薯试管薯诱导培养基，用于脱毒马铃薯幼苗快速繁殖或试管薯诱导。

所述的液体二氧化氯采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应快速制备，称取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，反应10分钟后，再加入450 mL蒸馏水，混匀即获得1000 mg/L二氧化氯水溶液。

所述的液体二氧化氯临用前加蒸馏水稀释至1～150 mg/L所需浓度。

进一步地，还包括用二氧化氯气体对培养基分装容器进行熏蒸消毒：二氧化氯气体采用亚氯酸钠与食品级盐酸反应生成，称取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，获1000 mg二氧化氯气体，置于相应体积密闭容器即得所需气体二氧化氯浓度；采用1～150 mg/L二氧化氯气体在密闭空间对培养基分装容器熏蒸灭菌30分钟。

所述的脱毒马铃薯幼苗快速繁殖培养基采用以下步骤制备：称取适量MS培养基成分及40 g/L蔗糖置于培养基总体积60%的1～150 mg/L二氧化氯水溶液，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，然后加热10分钟至培养基温度为50～60 ℃；用所配制培养基总体积40%的蒸馏水将凝固剂琼脂或植物凝胶于微波炉或电炉加热至完全溶解清澈；将消毒的培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH至5.8～6.0；用培养基分装容器分装，冷却后备用。

所述的脱毒马铃薯试管薯诱导培养基采用以下步骤制备：称取适量MS培养基成分及50～80 g/L蔗糖置于培养基总体积60%的1～150 mg/L二氧化氯水溶液，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，然后加热10分钟至培养基温度为50～60 ℃；用所配制培养基总体积40%的蒸馏水将凝固剂琼脂或植物凝胶于微波炉或电炉加热至完全溶解清澈；将消毒的培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH至5.8～6.0；用培养基分装容器分装，冷却后备用。

所述的脱毒马铃薯幼苗快速繁殖是将脱毒马铃薯幼苗剪成约1 cm长的带茎节的茎段，形态学下端插入配制的脱毒马铃薯幼苗快速繁殖培养基，在25±1 ℃条件下培养，光照14小时/天，光照强度6000 Lx。

所述的马铃薯试管薯诱导是将脱毒马铃薯幼苗剪成约1 cm长的带茎节的茎段，形态学下端插入脱毒马铃薯试管薯诱导培养基；培养条件为光照10小时/天，光照时温度25±1 ℃，光照强度6000 Lx，黑暗时温度19±1℃。

所述的MS培养基包括1900 mg/L 硝酸钾、1650 mg/L硝酸铵、170 mg/L 磷酸二氢钾、370 mg/L七水硫酸镁、440 mg/L二水氯化钙、27.85 mg/L 七水硫酸铁、37.25 mg/L乙二胺四乙酸二钠、22.3 mg/L 四水合硫酸锰、8.6 mg/L七水硫酸锌、6.2 mg/L 硼酸、0.83 mg/L 碘化钾、0.025 mg/L五水硫酸铜、0.25 mg/L二水合钼酸钠、0.025 mg/L六水氯化钴、2.0 mg/L甘氨酸、0.1 mg/L 盐酸硫胺素、0.5 mg/L 盐酸吡哆辛、0.5 mg/L 烟酸、100 mg/L 肌醇。马铃薯繁殖培养基为MS培养基添加40 g/L蔗糖，试管薯诱导培养基为MS培养基添加50～80 g/L蔗糖。所用培养基固化剂为8 g/L琼脂或3 g/L植物凝胶。

与现有技术相比，本发明的有益效果是:不需要高温高压灭菌锅即可快速实现培养基的高效灭菌、对培养容器材质无特殊需求，简化培养基消毒程序、延长消毒时间并大幅降低能耗费用，进而大幅降低脱毒马铃薯原原种生产费用，有助于促进脱毒马铃薯种源在生产中大规模应用，提高我国马铃薯生产水平。

附图说明

图1 是二氧化氯消毒培养基与高温高压灭菌对照培养基繁殖马铃薯“华1”幼苗照片。 图1中，左边是高温高压灭菌培养基繁殖的马铃薯“华1”幼苗，右边是二氧化氯消毒培养基繁殖的马铃薯“华1”幼苗。

图2 是培养瓶中二氧化氯消毒培养基诱导的马铃薯照片。白色箭头示意为所诱导的马铃薯。

图3 是二氧化氯消毒培养基诱导马铃薯“华1”待收获的试管薯照片。白色箭头示意为马铃薯。

图4 是二氧化氯消毒培养基诱导马铃薯“中5”待收获的试管薯照片。白色箭头示意为马铃薯。

图5 是收获的二氧化氯消毒培养基所诱导的“华1”马铃薯照片。

图6 是收获的二氧化氯消毒培养基所诱导的“中5”马铃薯照片。

具体实施方式

实施例一二氧化氯消毒培养基的制备

根据化学方程式 5NaClO+4HCl=4ClO₂+5NaCl+2H₂O，采用亚氯酸钠和食品级盐酸反应实现二氧化氯的快速制备。

称取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，反应10 分钟后，再加入450 mL蒸馏水，混匀即获得1000 mg/L二氧化氯水溶液。临用前用蒸馏水稀释至1～150 mg/L所需浓度。

脱毒马铃薯幼苗快速繁殖培养基配制：称取适量植物MS培养基成分置于所配制培养基体积60%的1～150 mg/L二氧化氯水溶液，加入40 g/L蔗糖，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，同时加热10分钟至培养基温度为50～60℃。将凝固剂琼脂或植物凝胶溶于所配制培养基体积40%的相应浓度二氧化氯水溶液，微波炉或电炉加热至完全溶解清澈。将培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH值至5.8～6.0，用培养基分装容器分装冷却后即可使用。

脱毒马铃薯试管薯诱导培养基配制：称取适量植物MS培养基成分置于所配制培养基体积60%的1～150 mg/L二氧化氯水溶液，加入50～80 g/L蔗糖，以每分钟100转的转速于磁力搅拌器上搅拌消毒20分钟，同时加热10分钟至培养基温度为50～60℃。将凝固剂琼脂或植物凝胶溶于所配制培养基体积40%的相应浓度二氧化氯水溶液，微波炉或电炉加热至完全溶解清澈。将培养基成分与溶解的凝固剂混匀，调节pH值至5.8～6.0，用培养基分装容器分装冷却后即可使用。

培养基分装容器采用1～150 mg/L二氧化氯气体在密闭空间熏蒸灭菌30分钟。取1.5 g亚氯酸钠于棕色瓶中，加入50 mL蒸馏水，待其完全溶解后，加入5 mL食品级盐酸，即可获1000 mg二氧化氯气体。置于相应体积密闭容器即得所需气体二氧化氯浓度。在密闭空间中实现对培养基分装容器的灭菌。

实施例二二氧化氯消毒培养基培养脱毒马铃薯幼苗

供试马铃薯品种包括华1、中5和A-R-I。在超净工作台内将脱毒马铃薯幼苗剪成约1 cm长的带茎节的茎段，形态学下端插入实施例一配制的脱毒马铃薯幼苗快速繁殖培养基。以高温高压灭菌法配制相同成分培养基为对照。在25±1℃条件下培养，光照14小时/天，光照强度6000 Lx。20天后，马铃薯幼苗可长至10厘米长，长势与高温高压灭菌对照培养基无异，且幼苗比对照分枝更多（图1）。过低二氧化氯浓度无法实现对培养基及马铃薯材料的彻底消毒，造成部分培养基和马铃薯幼苗污染。而过高二氧化氯浓度则对马铃薯细胞造成严重伤害，导致叶片枯黄、植株畸形，甚至死亡。对三个马铃薯品种，1～150 mg/L 液体二氧化氯均可实现对培养基和马铃薯幼苗的高效消毒，同时不对马铃薯脱毒苗造成不利伤害。表明1～100 mg/L 液体二氧化氯灭菌培养基适用于马铃薯脱毒苗的组织快繁培养，有利于马铃薯幼苗的大规模繁殖。

实施例三二氧化氯消毒培养基诱导马铃薯试管薯

以华1、中5和A-R-I为供试马铃薯品种。在超净工作台内将脱毒马铃薯幼苗剪成约1 cm长的带茎节的茎段，形态学下端插入实施例一配制的脱毒马铃薯试管薯诱导培养基。培养条件为光照10小时/天，光照时温度25±1℃，光照强度6000 Lx，黑暗时温度19±1℃。30天后，马铃薯试管薯开始形成（图2）。所试3个品种都成功诱导出试管薯，且试管薯诱导率均达到80%以上（图3、图4）。50天后收获试管薯并保存（图5、图6）。

本实施例中，1～150 mg/L 液体二氧化氯均实现对供试马铃薯培养基的彻底消毒并成功诱导试管薯，并且消毒效果可持续至60天左右，马铃薯幼苗生长繁殖与试管薯诱导可在同一培养瓶中完成，简化了试管薯诱导的操作步骤，可促进脱毒马铃薯试管薯的大规模生产。