本发明属于植物繁殖技术领域，涉及一种华南锥无性繁殖的方法。
背景技术：
华南锥（Castanopsis concinna (Champ. ex Benth.) A. DC.），壳斗科锥属，常绿乔木，高10-15米，很少达20米，胸径达50厘米，当年生枝及花序轴被黄或红棕色微柔毛及颇厚的细片状易抹落的蜡鳞层，三年生枝无或几无毛。分布于中国珠江三角洲以西南至广西岑溪、防城一带，北限见于广东的广宁县（越过北回归线稍北），沿海岛屿只见于香港。生于海拔约500米以下花岗岩风化的红壤丘陵坡地常绿阔叶林中。种子含淀粉，种仁可作木本粮食，味道能与板栗媲美；木材颜色鲜艳，材质坚重有弹性，耐水湿，是家具、器械、建筑的优良用材。是中国国家Ⅱ级重点保护野生植物。
目前，华南锥有性繁殖主要靠杂交授粉完成，即选用不同品种或同品种不同株间相互授粉，然而有性繁殖周期较长。组织培养技术是一种快速无性繁殖技术，选择华南锥优良家系或者无性系为材料，通过组织培养方法繁殖苗木，既可以满足生产上的数量要求，又可保持母本性状。
技术实现要素：
本发明的目的是针对黄檀组织培养过程中芽增殖系数低，生长缓慢等问题,提供一种生长效果好、扩繁快的黄檀嫩枝组培繁殖方法。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一种华南锥无性繁殖的方法，包括外植体选择、外植体处理、初始芽诱导培养、增殖培养、壮芽培养和生根培养工序，采集半木质化、生长健壮的当年生黄檀嫩枝作为外植体，对外植体进行修剪、灭菌消毒处理后接种于初始芽诱导培养基中获取初始芽，再将初始芽接种于增殖培养基中经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，具体操作步骤如下：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生黄檀嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10-15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间15-20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，培养30-35 d，初始芽萌发、生长；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，培养35-40 d，形成壮芽；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根；余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽。
以上所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 4.0-6.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+KT 1.0-2.0 mg/L+ZT 1.5-2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L。
以上所述的增殖培养基的配方为：改良1/2MS培养基+TDZ 6.0-8.0 mg/L+NAA 2.0-3.0 mg/L+ZT 0.5-1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L。
以上所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+TDZ 3.0-4.0 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L。
以上所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 1.5-2.5 mg/L+NAA 1.0-1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培养基的配方为：KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
以上步骤（3）所述的初始芽诱导培养的培育控制条件为：光培养、光照500-1000 lx，培养温度20±1℃；步骤（4）所述的增殖培养、步骤（5）所述的壮芽培养、步骤（6）所述的生根培养的培育控制条件均为：光培养，光照2500-4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：
1、本发明以黄檀当年生嫩枝作为外植体，经过初始芽培养基培养，初始芽萌动率90%以上；经过3-4个周期增殖培养，形成丛生芽，芽增殖系数5/30d-7/30d，再将丛生芽接入壮芽培养基中培养，最后将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，从而缩短了黄檀的育苗周期，节省育苗材料，克服了传统育苗方法中存在的育苗所需材料多、周期长等问题，大大降低了生产成本，提高了生产效率。
2、本发明将高≥2cm的单芽插入生根培养基中诱导生根，余下小芽丛继续增殖培养，使得材料能够多次继代，实现大量增殖，规模化生产壮芽，实现黄樟油素型樟树的扩繁。
3、本发明对MS基本培养基进行了改良，同时重点调整了与黄檀出芽壮芽相关元素，使得培养基更科学，更有针对性，更易促使黄檀芽诱导的发生、增殖和壮芽，效果显著。
4、本发明操作过程简便，培养周期短，继代芽产量大,并且质量优，增殖系数达到5以上的组培苗产业化技术要求，具有很好的经济效益、生态效益和社会效益。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。
实施例1：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生黄檀嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗10 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间15 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照500 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 4.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+KT 1.0 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 6.0 mg/L+NAA 2.0 mg/L+ZT 0.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+TDZ 3.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照2500 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为89%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 1.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培养基的配方为：以上所述改良MS培养基的组分和体积重量比为：KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B60.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
实施例2：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生黄檀嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 5.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+KT 1.5 mg/L+ZT 1.5 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 7.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+TDZ 3.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照3000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为92%；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 2.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
所述的改良MS培养基的配方为： KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4 340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。
实施例3：
（1）外植体选择：采集半木质化、生长健壮的当年生黄檀嫩枝作为外植体；
（2）外植体处理：将外植体置于自来水下冲洗15 min，然后去除外植体叶片，再将外植体浸泡在体积浓度 0.1%的升汞溶液中，控制浸泡时间20 min，最后用纯净水洗净药物，将外植体裁成带至少1个腋芽，1.5-3cm长的茎段，视茎段木质化程度分类置放容器内，备用；
（3）初始芽诱导培养：将步骤（2）得到的外植体接种于初始芽诱导培养基中培养，置于光培养、光照1000 lx，培养温度20±1℃的环境中培养30-35 d，初始芽萌发、生长；所述的初始芽诱导培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 6.0 mg/L+NAA 2.5 mg/L+KT 2.0 mg/L+ZT 2.0 mg/L+ VC 15 mg/L+叶酸10mg/L+VB2 15 mg/+琼脂3.0 g/L+葡萄糖25 g/L；
（4）增殖培养：将高≥1cm的初始芽接入增殖培养基中进行增殖培养，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中，35-40 d转接一次，循环往复，经3-4个周期的培养，形成丛生芽；所述的增殖培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 8.0 mg/L+NAA 3.0 mg/L+ZT 1.0 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.6 g/L+葡萄糖 30 g/L；
（5）壮芽培养：将步骤（4）得到的丛生芽进行切割，4-5颗芽/丛，插入壮芽培养基中，置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中培养35-40 d，形成壮芽；所述的壮芽培养基的配方为：改良MS培养基+TDZ 4.0 mg/L+NAA 1.5 mg/L+VC 15 mg/L+VB2 15 mg+L-半胱氨酸 20 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 25 g/L；
（6）生根培养：将步骤（5）得到的高≥2cm的单芽插入生根培养基中，余下小芽丛再次接种于步骤（4）的增殖培养基中继续增殖，然后再重复步骤（5），循环往复，获得大量壮芽；生根培养是置于光培养，光照4000 lx，每日光照16 h，培养温度25-28℃的环境中诱导生根，生根率为93%；；所述的生根培养基的配方为：1/2改良MS培养基+TDZ 2.5 mg/L+NAA 1.5 mg/L+琼脂 3.5 g/L+葡萄糖 30 g/L。
以上所述的改良MS培养基的配方为： KNO3 874 mg·L-1；NH4NO3 850 mg·L-1；CaCl2·2H2O 295 mg·L-1；MgSO4·7H2O 318 mg·L-1；Ca(NO3)2·4H2O 600 mg·L-1；KH2PO4340 mg·L-1；MnSO4·H2O 22.3 mg·L-1；ZnSO4·7H2O 8.6 mg·L-1；CuSO4·5H2O 0.025 mg·L-1；H3BO3 6.2 mg·L-1；Na2MoO4·2H2O 0.025 mg·L-1；KI 0.83 mg·L-1；CoCl2·6H2O 0.025 mg·L-1；维生素B1 1.0 mg·L-1；维生素B6 0.5 mg·L-1；烟酸 0.5 mg·L-1；甘氨酸 2.0 mg·L-1；肌醇 70 mg·L-1。