本发明涉及植物组织培养技术领域，具体涉及一种大乌嘴金针菜的提纯复壮方法。
背景技术：
金针菜又名“黄花菜”，属百合科萱草属植物，具有丰富的营养成分，与香菇、木耳、冬笋，同为素菜中的珍品。主要分布在江苏、湖南、湖北、四川等地，宿迁是江苏省金针菜主要产地之一，尤以“大乌嘴”花蕾长而粗壮，色泽黄亮，肉质紧实，口感甜香脆，品质优而闻名中外；然而，由于一直采用传统的栽培技术，忽视了大乌嘴的提纯复壮工作，导致其混杂严重、种性退化、品质和产量下降；针对这一问题，本发明提供一种大乌嘴金针菜组培快繁方法，包括外植体的建立、启动培养、继代培养、生根培养、炼苗和移栽等步骤。
技术实现要素：
本发明针对背景技术中的不足，提供一种大乌嘴金针菜的提纯复壮方法，目的在于：促使大乌嘴金针菜能在短期内进行快速繁殖，在繁殖的过程中保持大乌嘴金针菜的原种性、稳定性及一致性。
本发明的目的是通过如下途径实现的：
一种大乌嘴金针菜的提纯复壮方法，包括如下步骤：
（1）金针菜母株选择
选择环境：需在连续晴天为3天以上的上午，无大风和空气污染的情况下；
对母株的形态要求：具有典型性状，无病害，形态健壮；
取株要求：离根部5cm处挖出整株，轻轻抖落根部泥土，减少植株表面附带的微生物和害虫；
（2）外植体剥取
剥去外层叶片，用刀片切取茎尖作为外植体，注意刀口要平整，切割次数尽量少，一般大小约为0.5cm*0.5cm*0.5cm；
（3）对外植体进行消毒
将茎尖放入大烧杯中，用水摇晃冲洗3次后，加入质量浓度3%洗衣粉或洗洁精溶液，再放在水龙头下，流水冲洗2小时后用镊子夹取，之后再用无菌水冲洗3次，然后放入3%的山农一号杀灭剂，灭菌18小时；
（4）初代培养
在无菌滤纸上将表面灭菌处理后的外植体擦干，切除外表皮，之后放入初代培养基中进行培养；3天后观察有无污染，7～15天后，幼芽生出；所述初代培养基包括ms4.74g/l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l，ph5.8～6.0；
（5）增殖培养
将初代培养生出的幼芽切割掉，留下茎尖部分接入到增殖培养基1中进行培养；培养周期为45～60天，诱导出愈伤组织，然后再放入增殖培养基2中进行培养，培养周期为45～60天，诱导出新芽；所述增殖培养基1包括ms4.74g/l+6-ba3.0mg／l+naa0.3～0.5mg／l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l，ph5.8～6.0；所述增殖培养基2包括ms4.74g/l+6-ba3.0mg／l+naa0.1～0.2mg／l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l，ph5.8～6.0；
（6）壮苗培养
将经过增殖培养基2培养后的幼芽上的愈伤去除后，接入壮苗培养基中，培养周期为20～30天后，幼苗高度可达2～5cm；所述壮苗培养基包括ms4.74g/l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l，ph5.8～6.0；
（7）生根培养
将经过壮苗培养基培养后的幼苗中生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基中进行培养，培养20～30天后幼苗基部长出数根新根；所述生根培养基包括1/2ms39.3g/l+naa0.2mg/l（或者iba0.2mg/l）+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l,ph5.8～6.0；
（8）组培苗炼苗移栽
①组培苗选取标准
幼苗基部长出3条以上、长1～3cm的新根，长势好、色白健壮，基本无愈伤组织，苗高一般3～5cm，叶片数一般不少于3片，作为组培苗；
②组培苗炼苗
将选取的组培苗，进行炼苗处理，先旋松瓶盖1～3天，然后打开瓶盖2～4天，之后炼苗3～7天；
③移瓶
用手指或镊子轻轻取出瓶中的组培苗，放入清水内洗去琼脂，并将其进行分级等待移栽，冬季水温为20℃～25℃；
④组培苗定植
将经过移瓶清洗的组培苗放入混合基质的穴盘中，首先用竹签在混合基质的穴盘每个穴位上打下能容纳根系的孔，然后再把组培苗逐一放入每个穴位的孔中，最后覆土压实，分类，分日期摆放整齐；
所述混合基质包括泥碳土、珍珠岩和蛭石，三者的体积比为3：1：1，此时组培苗成了穴盘苗；
（9）穴盘苗炼苗
将穴盘苗放在温室大棚中，先用遮阳网覆盖，第一天上午8：00-10:00进行采光、通风，然后每日逐渐增加采光和通风时间，7天后，待穴盘苗长出新根后，进行正常的管理，温度保持在15～25℃，相对湿度保持在60～80%，移栽第4周～8周，每周喷施叶面肥一次，氮:磷:钾=15:15:15，浓度为1000倍，移栽8周后，视穴盘苗生长情况，浓度逐渐增加；培育2～3个月，穴盘苗长至10～15cm，苗健壮、挺拔和新鲜，叶片在8片叶以上。
本发明的有益效果：
本发明操作简单、成本低、能有效的促使大乌嘴金针菜在短期内进行快速繁殖，在繁殖的过程中保持大乌嘴金针菜的原种性、稳定性及一致性，采用本发明的方式进行组织培养，在穴盘中培育2～3个月后，穴盘苗长至10～15cm，苗健壮、挺拔和新鲜，叶片在8片叶以上，形态完整，叶片大小协调，叶色具原品种特性，有光泽，具有完整而发达的根系，根系充满穴盘孔，能轻易拔出而基质不散，同一批次90%以上的苗高达到标准，并且无病虫害，经过多次实验反复研究表明，本发明重复利用率高，适合宿迁地区大面积区域种植。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的描述。
实施例
准备工作，购买济南普朗特生物科技有限公司生产的山农一号（iii型），许可证号：201300720；购买上海雨涵生物科技有限公司生产的ms培养基，编号为a0025-500g；购买济南普朗特生物科技有限公司生产的1/2ms干粉培养基，许可号：20120805；制作初代培养基：称取ms4.74g/l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l溶于蒸馏水中，调节ph5.8～6.0；制作增殖培养基1：在制作完成的初代培养基中+6-ba3.0mg／l+naa0.3～0.5mg／l，制作增殖培养基2：在制作完成的初代培养基中+6-ba3.0mg／l+naa0.1～0.2mg／l；制作壮苗培养基：与初代培养基相同；制作生根培养基：1/2ms39.3g/l+naa0.2mg/l或iba0.2mg/l+蔗糖20g/l+琼脂粉8g/l溶于蒸馏水中，调节ph5.8～6.0；所述一种大乌嘴金针菜的提纯复壮方法，包括如下步骤：（1）金针菜母株选择：需在连续晴天为3天以上的上午，无大风和空气污染的情况下；母株具有典型性状，无病害，形态健壮；离根部5cm处挖出整株，轻轻抖落根部泥土，减少植株表面附带的微生物和害虫；（2）外植体剥取：剥去外层叶片，用刀片割去根系2-5cm，直接剥取茎尖做外植体，一般大小约为0.5cm*0.5cm*0.5cm；（3）外植体消毒:将茎尖放入大烧杯中，用水摇晃冲洗3次后，加入质量浓度3%洗衣粉或洗洁精溶液，流水冲洗2小时后用镊子夹取，之后再用无菌水冲洗3次，然后放入3%的山农一号杀灭剂，灭菌18小时；所述山农一号是一种杀灭剂，可以直接从市场中买到；（4）初代培养，用无菌滤纸将灭菌处理后的外植体表面擦干，在不锈钢托盘上切割掉外表层，之后放入初代培养基中进行培养；3天后检查有无污染，初代培养7～15天后，幼芽生出；（5）增殖培养：将初代培养生出的幼芽切除，留下茎尖部分接种到增殖培养基1中进行培养；培养周期为45～60天，诱导出愈伤组织，然后再放入增殖培养基2中进行培养，培养周期为45～60天，诱导出新芽；（6）壮苗培养：将经过增殖培养后的新芽上的愈伤切除后，接入壮苗培养基中，培养周期为20～30天后，幼苗高度可达2～5cm；（7）生根培养：选取经过壮苗培养后的幼苗中生长健壮、叶色正常、叶片舒展、适于生根的无根苗，接种在生根培养基中进行培养，培养20～30天后幼苗基部长出数根新根；（8）组培苗炼苗移栽：①组培苗选取标准：幼苗基部长出3条以上、长1～3cm的新根，长势好、色白健壮，根长适中，基本无愈伤组织，苗高一般3～5cm，叶片数一般不少于3片；②炼苗：将选取的组培苗，先旋松瓶盖1～3天，然后打开瓶盖2～4天，之后炼苗3～7天；③移瓶：用手指或镊子轻轻取出瓶中的组培苗，放入清水内洗去琼脂，并将其进行分级等待移栽，冬季水温为20℃～25℃；④定植：将经过移瓶清洗的组培苗移入混合基质的穴盘中，首先用竹签在混合基质的穴盘每穴中间打下能容纳根系的孔，然后再把组培苗逐一放入孔中，最后覆土压实，分类，分日期摆放整齐；所述混合基质包括泥碳土、珍珠岩和蛭石，三者之间的比例为3：1：1，此时完成组培苗向穴盘苗转化；（9）穴盘苗炼苗：将穴盘苗放在温室大棚中，先用遮阳网覆盖，第一天上午8：00-10：00进行采光、通风，然后每日逐渐增加采光和通风时间，7天后，待穴盘苗长出新根后，进行正常的管理，温度保持在15～25℃，相对湿度保持在60～80%，移栽第4周～8周，每周喷施叶面肥（氮:磷:钾=15:15:15，浓度为1000倍）一次，移栽8周后，视穴盘苗生长情况，浓度逐渐增加；培育2～3个月，穴盘苗长至10～15cm，苗健壮、挺拔和新鲜，叶片在8片叶以上。
说明书中ms是指上海雨涵生物科技有限公司生产的ms培养基，编号为a0025-500g；6-ba是指6-苄氨基腺嘌呤；naa是指萘乙酸；iba是指吲哚丁酸。