本发明属于植物筛选育种领域，具体涉及一种油亮型抗病砧用南瓜材料的筛选方法。
背景技术：
南瓜资源丰富多样，但我国对很多优秀的南瓜种质资源没有作出系统完善的鉴定和评价，材料的利用率不高。
近年来随着嫁接技术的推广和公众的认可，嫁接黄瓜的种植面积也在不断扩大，同时规模化种植和连作加重导致的嫁接病害也日趋严重。而南瓜的主要病害如病毒病、枯萎病、白粉病等的抗病性研究滞后于生产。
上世纪80年代以来，国内一些育种单位开始砧用南瓜方面的育种研究，目前我国南瓜品种选育主要是利用杂种优势，而有关南瓜杂种优势、性状遗传规律等基础研究报道较少，因此很多目标性状的遗传与稳定规律不为人知，导致目前砧用南瓜选育处于比较混乱的状态，利用传统的杂种优势育种最常用的筛选方法是通过农家、市场和购买等方式搜集南瓜材料及品种，进行多代定向选育成为性状稳定的自交系，株系f5代性状稳定后再进行嫁接试验，进行亲和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目标性状的筛选。
其中抗病性的筛选方法目前有两种：(1)以采取病圃地块种植鉴定为主要手段，划定常年实验地，在嫁接品种主栽区采集病害严重的土壤样本，以每季栽培定向穴施混拌病土定植，在栽培过程中创造利于发病的条件(高温、高湿等)，观察目标材料的发病情况。(2)从种子发芽期开始到整个生长期依据病害的发病时间与要求的环境特点实时接种病原微生物，依据其发病指数筛选材料。
亲和力和油亮性筛选方法为：将纯合材料与接穗嫁接，观察其成活率，定植后能完成正常的成活、伸蔓、开花、结果的生长过程且在行业标准以上，即为亲和力合格；黄瓜嫁接后，以黄瓜实生苗(品种不脱蜡粉)为空白对照，黄瓜瓜条脱去蜡粉，依据其油亮程度比较筛选。
现有的筛选方法存在以下四个问题：
一是选育时间长，管理成本高。传统的材料纯化与创造是将资源收集后按类型整理归类，进行种植评价，自交留种，结合育种目标进行优劣评价筛选，目标性状稳定得到种子后再嫁接进行亲和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目标性状的筛选。整个流程下来大约需要五年左右的时间。
二是育种目标性状明确，但筛选过程中极易丢失。现有的材料纯化与创造是将资源收集后按类型整理归类，进行种植评价，自交留种，结合育种目标进行优劣评价筛选，目标性状稳定后再嫁接进行亲和力、共生力、油亮性、抗病性等一系列砧用目标性状的筛选。这种筛选方式只能将南瓜实生苗性状表现好的筛选出来，可能选丢了用作砧木时某些性状表现突出的好材料。
三是砧木材料自交纯合筛选过程中，每个世代种植数量、入选数量、选择手段不规范。现有技术在砧木材料筛选过程中，筛选方向(1)要求种子肉薄、果腔大、种子多且仁厚，(2)抗性、耐高温、高湿或耐低温，(3)长势、根系发达、植株旺盛，(4)抗病性。根据这几项选育目标筛选出一定数量的材料加代至株系稳定，在筛选过程中工作量大，入选数量多(一般需要选近100株左右)，在筛选完成后进行嫁接试验，亲和力和共生力测定时，需要每个株系的每份材料都进行大量的试验，数据才能具有一定的说服力，这种不规范的筛选方式会随着自交系的加代弊端越来越多。
四是黄瓜育种综合抗性水平有待提高。目前威胁黄瓜设施生产的病害主要有地上病害和地下病害两部分，地下病害主要指各种土传病害，如枯萎病、疫病、根腐病等等，地上部分病害主要指黄瓜的叶部病害如白粉病、病毒病，霜霉病，灰霉病等等，近年来随着嫁接苗应用的普及，地下各种土传病害得到重视，但砧木的抗叶部病害被忽视，有关研究表明嫁接有一定诱导作用，来自砧木的遗传信号物质能通过胞间连丝和维管束转移到接穗中并调控接穗的生长发育模式，砧木的抗叶部病害能力能传导到接穗当中，选育对接穗叶部抗病性影响强的砧木材料，可有效提高黄瓜育种的综合抗病水平。在南瓜材料和黄瓜嫁接共同生长的一个时期内，同时鉴定南瓜叶部病害抗病能力和黄瓜植株的叶部抗病能力，选出对黄瓜接穗叶部抗病能力影响大的南瓜材料，不仅能够提高农户栽培种植黄瓜植株的综合抗病水平，且可大大缩短育种时间。
技术实现要素：
针对现有技术中南瓜砧木筛选的问题，本发明的目的是要提供一种育种年限短、效率高、手段规范、且能同时保留南瓜实生苗及砧木优良性状的油亮型抗病砧用南瓜材料的筛选方法。
一种油亮型抗病砧用南瓜材料的筛选方法，步骤如下：
(1)嫁接：收集不同种类的南瓜种质材料，并将南瓜种子播种，每个品种播种15-25株，待南瓜苗长至两叶一心时嫁接黄瓜接穗，嫁接前将砧木南瓜的真叶掐掉，留住生长点；嫁接苗定植10-15株，并保留两条蔓，一条黄瓜蔓，一条南瓜蔓；
(2)黄瓜油亮性筛选：以不脱蜡粉的黄瓜实生苗为空白对照，嫁接苗之间进行比较筛选，选出黄瓜脱蜡粉最明显、亮度最好的材料，在黄瓜结瓜2-3条后及时将黄瓜蔓去除，只保留南瓜蔓以待鉴定筛选抗病性状或留种；
(3)南瓜砧木抗病性筛选：对嫁接苗进行抗枯萎病、抗白粉病、抗cgmmv的筛选，抗病且黄瓜油亮性材料自交并保留f1代南瓜种子；南瓜砧木抗枯萎病筛选在嫁接苗定植时开始，抗白粉病和cgmmv筛选在嫁接苗定植后开始，或在去掉黄瓜蔓后开始；
(4)稳定性状的筛选：将f1代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤(1)-(3)筛选出f2代南瓜种子；将f2代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤(1)-(3)筛选出f3代南瓜种子；将f3代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤(1)-(3)筛选出f4代南瓜种子；将f4代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤(1)-(3)筛选出f5代南瓜种子，即为稳定遗传材料。
进一步地，步骤(1)中在嫁接前，将砧木、接穗、嫁接针、嫁接刀和手都用普力克溶液杀菌，防止嫁接伤口感染。
进一步地，步骤(1)中采用插接方法嫁接，操作方便，成活率高，接口位置高，防病效果好。
进一步地，步骤(1)中嫁接完后用地膜遮阴保湿3-4天，之后掀开地膜，一般刚掀开地膜，苗子比较脆弱，为防止闪苗，地膜不宜长时间掀开，以嫁接苗不萎蔫为前提，合理覆盖地膜，嫁接5-7天后嫁接苗基本完全愈合，可撤去地膜，若光照不强，10天后可撤去遮阴网，以嫁接苗不萎蔫为前提。
进一步地，步骤(1)中嫁接苗愈合期间，南瓜比接穗的生长速度要快，掀开地膜后去掉1-2片南瓜真叶，防止遮光导致接穗愈合慢同时与接穗争夺养分。
进一步地，步骤(3)中抗枯萎病的筛选采用浸根接种法：准备浓度为106-107个孢子/ml的尖孢镰刀菌孢子悬浮液，将2片真叶期的嫁接苗从营养土中取出，水洗冲掉根系表面的营养土，剪掉嫁接苗1/5-1/3的根系造成侵染伤口，将剩下的根系全部没于孢子悬浮液中，8-12分钟后取出，然后定植于试验地中；每份材料须接种至少10株嫁接苗作为重复；定植后创造利于致病菌发病的条件(温度21-30℃)，观察目标材料的发病情况，接种后18-25天，植株发病情况稳定，即可评价出品种的抗病性。
更进一步地，所述尖孢镰刀菌孢子悬浮液的制备方法为：取枯萎病发病严重(4级)的南瓜植株，从发病部位采集枯萎茎秆，在无菌条件下，放入pda(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板上在28℃的培养箱中培养2天后观察菌落情况，挑取菌丝进行纯化和培养，培养8-10天，待纯化的菌丝长满平板然后打菌饼于pdb(马铃薯液体培养基)中，25℃，180rpm，在恒温摇床内摇菌24-36小时，镜检分生孢子，并用血球计数板测定孢子浓度。然后用灭菌水制成所需浓度的悬浮液。
进一步地，步骤(3)中抗白粉病的筛选采用喷雾接种法接种，用喷雾器将浓度为105-106个孢子/ml的白粉病菌孢子悬浮液均匀的喷施在南瓜老叶的正反两面，喷施至菌液布满叶片但不下滴，接种后保持温度20～25℃，湿度为70-80％，黑暗培养20-30小时，然后转入昼温22-28℃，夜温15-20℃的温室内正常管理，接种7天开始观察，20天内病情基本稳定。白粉病属于高温低湿型，在温度过高或过低的环境不适合其病原孢子发病，因此在抗性筛选时温度和湿度都需严格控制。
更进一步地，所述白粉病菌孢子悬浮液的制备方法为：直接在田间采集新鲜叶子上粉末状分生孢子，加入蒸馏水，离心3～5分钟，镜检并用血球计数板计数，用无菌水配制成浓度为105-106个孢子/ml的悬浮液。从悬浮液配制好到接种不能超过2小时。
进一步地，抗黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)的筛选采用摩擦接种法接种，选择生长健康的南瓜叶，在叶片上均匀地撒少量金刚砂，用纱布蘸取病毒接种液，在叶面朝一个方向轻轻摩擦3-5次；7天后开始观察症状，每隔7天调查1次，一个月即能稳定发病症状得到鉴定结果。
更进一步地，所述病毒接种液的制备方法为：将cgmmv在南瓜叶上扩繁，取发病明显(7级以上)的新鲜叶片，按照质量体积比1:10加入磷酸缓冲液，并在研钵中充分研磨，纱布过滤，现配现用。
进一步地，在材料株系筛选到第5代性状基本稳定后，开始用盆栽验证试验地鉴定结果，在保证包含花盆、盆栽用土、嫁接苗在内的试验用品不携带任何致病菌的条件下进行致病菌的接种，从而验证筛选的准确性。
本发明在一个嫁接栽培世代中解决育种目标选育和抗病力筛选的主要内容，包括：南瓜砧木的抗cgmmv、白粉病、枯萎病鉴定筛选；砧木南瓜的嫁接亲和力，籽粒饱满度等指标的鉴定筛选；黄瓜嫁接后的瓜条油亮性状的鉴定筛选。每一代自交系都进行嫁接试验，能在每一代都淘汰一部分亲和力或者共生力差、抗病性差的材料，材料优中选优，从而事半功倍。相比于现有筛选南瓜砧木材料的方法，本发明的方法具备以下有益效果：
(1)缩短选育年限，提高筛选准确性。传统筛选方法是对砧用南瓜材料抗病性筛选并得到种子后，再进行嫁接试验，鉴定这一材料的砧用表现，如嫁接亲和力及长势，本发明方法在砧木材料筛选或加代过程中就进行嫁接试验，利用嫁接技术，直接以砧用目标性状为出发点，将处在fn代的材料嫁接，同时留住自身的南瓜生长点，这样在整个生长期既能观察黄瓜嫁接后油亮性表现，又能进行实生苗抗病性等一系列目标性状的评价筛选，根据材料的田间表现结合目标性状，优势突出的材料留住南瓜蔓自交进行下一步选育工作，从而缩短一半的选育时间。
(2)每个世代种植数量，入选数量，选择手段规范且评价方法科学，每一代自交系都进行嫁接试验，能在每一代都淘汰一部分亲和力或者共生力差的材料，材料优中选优。
(3)筛选出的材料更加准确，有效。在抗枯萎病筛选过程中，用培养基培养的病原微生物制成孢子悬浮液接种到砧木根部的方法代替传统直接定植后在根部撒病土的方式。通过人工对病原菌浓度进行调控，可缩短材料的发病周期，提高筛选效率，对淘汰的材料及时拔除，降低管理成本；也保证了每株嫁接苗接种的病原菌数量相同，控制变量，保证了其筛选结果的准确性。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明实施例中所用到的材料如下：
pda(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：200g土豆，20g葡萄糖，10g琼脂，1l水，121℃高压灭菌20min。
pdb(马铃薯液体培养基)：200g土豆，20g葡萄糖，1l水，121℃高压灭菌20min。
枯萎病病情分级标准：0级：茎基部无褐色；1级：茎基部褐变；2级：茎基部1/2褐变；3级：茎基部2/3以上褐变；4级：茎基部到顶端所有维管束褐变，根部坏死。
白粉病病情分级标准：0级：无病症；1级：叶正面的病斑面积小于30％，叶背面无病斑；3级：叶正面的病斑面积大于30％，叶背面的病斑面积小于10％；5级：叶正面的病斑面积大于30％，叶背面的病斑面积大于10％，叶柄上出现少量病斑；7级：叶正面覆盖霉层，叶背面的病斑面积大于10％，叶柄上有较多病斑，主茎上出现少量病斑；9级：叶正面覆盖霉层，叶背面的病斑面积大于10％，叶柄上有较多病斑，主茎上覆盖霉层。
黄瓜绿斑驳花叶病毒(cgmmv)病情分级标准：0级：无任何症状；1级：心叶明脉，轻微花叶；3级：心叶及少数叶片花叶；5级：心叶及多数叶片花叶，少数叶片皱缩、畸形，或明脉、叶柄有褐色坏死斑点，植株轻微矮化；7级：重花叶，多数叶片皱缩，变细呈畸形或茎部有褐长条斑，植株矮化；9级：重花叶，病叶严重畸形，植株严重矮化，或成丛枝状，甚至枯死。
发病率％＝(发病株数/调查总株数)*100％。
按照本发明方法筛选油亮型抗病砧用南瓜材料，具体步骤如下：
第一步，嫁接。
收集不同种类的南瓜种质材料，将南瓜种子播种，每种种质材料种植20株，待南瓜苗长至两叶一心时嫁接黄瓜接穗，嫁接前将砧木南瓜的真叶掐掉，留住生长点。砧木、接穗、嫁接针、嫁接刀和手在嫁接前都用普力克溶液杀菌，防止嫁接伤口感染。采用插接方法嫁接，操作方便，成活率高，接口位置高，防病效果好。
嫁接完后用地膜遮阴保湿3天，之后掀开地膜，嫁接6天后嫁接苗基本完全愈合，撤去地膜。掀开地膜后适当去掉1-2片南瓜真叶。
第二步，嫁接苗抗枯萎病的筛选。
尖孢镰刀菌孢子悬浮液的制备方法：取枯萎病发病严重的南瓜植株，从发病部位采集枯萎茎秆，在无菌条件下，放入pda平板上在28℃的培养箱中培养2天后观察菌落情况，挑取菌丝进行纯化和培养，培养9天，待纯化的菌丝长满平板然后打菌饼于pdb中，25℃，180rpm，在恒温摇床内摇菌30小时，镜检分生孢子，并用血球计数板测定孢子浓度。然后用灭菌水制成浓度为107个孢子/ml的悬浮液。
采用浸根接种法筛选：将2片真叶期的嫁接苗从营养土中取出，水洗冲掉根系表面的营养土，剪掉嫁接苗1/4的根系造成侵染伤口，将剩下的根系全部没于孢子悬浮液中，10分钟后取出，然后定植于试验地中；每份材料接种10株嫁接苗作为重复；定植后创造利于致病菌发病的条件(温度25℃)，观察目标材料的发病情况，期间将发病植株(2级及以上)及时拔除，接种后20天，植株发病情况稳定，即可评价出品种的抗病性。剩余的抗枯萎病嫁接苗继续用于其他性状的筛选。
第三步，嫁接苗抗白粉病的筛选。
白粉病菌孢子悬浮液的制备：直接在田间采集新鲜叶子上粉末状分生孢子，加入蒸馏水，离心3～5分钟，镜检并用血球计数板计数，用蒸馏水配制成浓度为106个孢子/ml的悬浮液。从悬浮液配制好到接种不能超过2小时。
采用刷叶接种法筛选：第二步剩余嫁接苗用喷雾器将浓度为106个孢子/ml的白粉病菌孢子悬浮液均匀的喷施在南瓜老叶的正反两面，喷施至菌液布满叶片但不下滴，接种后保持温度22℃，湿度为75％，黑暗培养24小时，然后转入昼温25℃，夜温16℃左右的温室内正常管理，接种7天开始观察，期间将发病植株(3级及以上)及时拔除，20天内病情基本稳定，作出抗病性评价。
第四步，黄瓜油亮性筛选。
定植30天左右时黄瓜瓜条长成，此时正处在抗白粉病性状筛选期，两种性状筛选同时进行。以黄瓜实生苗(品种为不脱蜡粉)为空白对照，嫁接苗之间进行比较筛选，选出脱蜡粉最明显、亮度最好的材料。在黄瓜结瓜2-3条可鉴定出油亮性后及时将黄瓜蔓去除，只保留南瓜蔓以待鉴定筛选抗cgmmv性状并留种。期间将脱蜡粉差的植株及时拔除，剩余的抗枯萎病、抗白粉病、油亮性嫁接苗继续用于其他性状的筛选。
第五步，南瓜砧木抗cgmmv性筛选。
将从商业渠道购买的cgmmv病毒在南瓜叶上扩繁，取发病明显的新鲜叶片，按照质量体积比1:10加入磷酸缓冲液，并在研钵中充分研磨，纱布过滤，现配现用。
采用摩擦接种法筛选：选择生长健康的南瓜叶，在叶片上均匀地撒少量金刚砂，用纱布蘸取病毒接种液，在叶面朝一个方向轻轻摩擦4次；7天后开始观察症状，期间将发病植株(3级及以上)及时拔除，每隔7天调查1次，一个月即能稳定发病症状得到鉴定结果。剩余的抗cgmmv、抗枯萎病、抗白粉病、油亮性嫁接苗，单株自交得到f1代南瓜种子。
第六步，稳定性状的筛选。
将f1代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复第一至五步得到f2代南瓜种子；将f2代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤第一至五步得到f3代南瓜种子；将f3代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤第一至五步得到f4代南瓜种子；将f4代南瓜种子播种得到南瓜苗，重复步骤第一至五步得到f5代南瓜种子，为稳定遗传材料。
第七步，筛选准确性验证。
在材料株系筛选到第5代性状基本稳定后，开始用盆栽验证试验地鉴定结果，在保证包含花盆、盆栽用土、嫁接苗在内的试验用品不携带任何致病菌的条件下进行致病菌的接种，从而验证筛选的准确性。
表1本发明筛选到的南瓜砧木性状
本发明可用五个生长周期选育出油亮型抗病砧用南瓜，育种时间相比于传统方法缩短一半。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。