本发明涉及植物生物
技术领域：
。更具体地说，本发明涉及一种促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法。
背景技术：
：罗汉果甜苷v属于葫芦烷型四环三萜类物质，本课题组前期根据罗汉果转录组数据，已推导出甜苷v可能的生物合成途径。罗汉果甜苷v生物合成的前体物质是异戊烯二磷酸(ipp)和3,3-二甲基烯内基焦磷酸(dmapp)，二者是通过甲羟戊酸(mva)和甲基赤藓糖醇磷酸化(mep)两条途径形成，mva途径发生在胞质中，mep途径发生在质体中。来源于上述两途径的ipp或dmapp经牻牛儿基焦磷酸合酶(gps)催化形成牻牛儿基焦磷酸(gpp)，ipp与gpp在法呢基焦磷酸合酶(fps)的催化作用下进而形成法呢基焦磷酸(fpp)，然后经角鲨烯合酶(ss)、角鲨烯环氧化酶(se)的催化形成2,3-氧化角鲨烯，葫芦二烯醇合酶(cs)进一步催化形成葫芦二烯醇，最后在cyp450酶和葡萄糖基转移酶的作用下，形成罗汉果甜苷v。异戊二烯类物质的产生受到限速酶活性的严格调控，一直被认为在其生物合成途径中起着重要的调控作用。作为异戊二烯途径中的限速酶，cyp450酶基因的表达对罗汉果甜苷v的生物合成起着决定性作用。过表达cyp450酶基因，可以促进罗汉果甜苷v的积累；相反，如果抑制cyp450酶基因的表达，罗汉果甜苷v的产量将显著降低。然而，cyp450酶基因是个超基因家族，本课题组前期研究发现，cyp87d18与罗汉果甜苷v的合成途径有一定关联。现有技术中未见有促进罗汉果cyp87d18基因表达来提高罗汉果中甜苷v含量的报道。技术实现要素：本发明的一个目的是解决至少上述问题，并提供至少后面将说明的优点。本发明还有一个目的是提供一种通过茉莉酸甲酯处理罗汉果组培苗或其果实来促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，为有效促进罗汉果中甜苷v含量积累奠定基石。本发明还有一个目的是提供一种通过对罗汉果组培苗根系处理与花粉处理进一步促进罗汉果cyp87d18基因表达来提高罗汉果甜苷v含量的方法。为了实现根据本发明的这些目的和其它优点，提供了一种促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将罗汉果组培苗接种于诱导培养基中诱导培养至少30天，其中，诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为50-400μmol/l。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，诱导培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50-400μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为150-200μmol/l。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒5天，所述诱导液中含有浓度为50-400μmol/l的茉莉酸甲酯。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导液中含有浓度为100-150μmol/l的茉莉酸甲酯。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括有0.20mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l独角金内酯。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述组培苗经所述诱导培养之前经过根部处理，所述根部处理具体包括：将组培苗根系中根长小于最长根长度1/4的短根剪除，再将2-3条粗壮根用无菌刀分别划2-3个伤口，伤口深度小于0.2mm，再用经过预浸泡处理的玉米须包覆组培苗的根系，连续变温处理10-12次，然后将组培苗上的玉米须去除，置于100-200高斯磁场中磁化处理1h；每次变温处理均为将根系包覆有玉米须的组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min；所述预浸泡处理是指将玉米须经洗净干燥后，于30-40℃水温的预浸泡溶液浸泡处理15min，所述预浸泡溶液中含有1mg/l的纳米氧化锌、2g/l柠檬酸、3.5μg/l的天花粉、0.18g/l葡甘露聚糖，以磁化水为溶剂。优选的是，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，罗汉果组培苗移栽后，于盛花期早上6-7点摘取雄株2-3级侧蔓上的花朵，取花粉，将花粉先置于花粉浸泡液中用频率为3khz的超声波振荡器中搅拌处理2h，再经400目纱布过滤后，将纱布连同滤上物一起平摊置于带盖的玻璃器皿中，盖上设有通气孔，将带盖玻璃器皿连同花粉一起置于40℃恒温干燥机中干燥8h，密封储存于4℃下备用，授粉前将其取出置于相对湿度为85-90％的环境中吸湿24h；其中，所述花粉浸泡液中含有20g/l的蜂蜜、0.10mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l视黄酸、0.02mg/l独角金内酯，溶剂为磁化水。本发明的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法操作简单，成本低，对环境友好，适于规模生产，具有较强的实用性和推广价值，至少包括以下有益效果：1)本发明通过在罗汉果组培苗移栽前对其进行采用含有茉莉酸甲酯的诱导培养基中诱导培养，长期内以刺激并诱导罗汉果中cyp87d18基因的表达，从而促进cyp450酶基因过表达，促进罗汉果甜苷v的生物合成，提高其产量；2)本发明通过在罗汉果组培苗移栽后，于授粉后20-30d采用含有茉莉酸甲酯的诱导液处理罗汉果表面，在短期内进一步刺激并诱导罗汉果中cyp87d18基因的表达，从而促进促进罗汉果甜苷v的生物合成；3)本发明通过在诱导培养基中加入适宜量的油菜素甾醇和独角金内酯，与茉莉酸甲酯起协调作用，进一步诱导刺激罗汉果组培苗表达cyp87d18基因；4)本发明通过对罗汉果组培苗诱导培养前进行根系处理，以去除弱根，划伤刺激强根，并以连续变温处理与磁场处理结合，刺激并胁迫罗汉果组培苗果实中甜苷v生物合成途径中关键酶基因cyp87d18的高表达，从而进一步提高罗汉果甜苷v的含量；5)本发明通过对用于授粉的雄株花粉采用花粉浸泡液结合超声振荡处理，充分发挥花粉浸泡液中主要成分的作用，其中蜂蜜、磁化水结合超声波的空化作用将花粉浸泡液中的油菜素甾醇、视黄酸和独角金内酯充分包裹雄株花粉，强烈诱导并调控罗汉果雌株授粉后酶基因cyp87d18高表达，促进cyp87d18基因表达量积累，从而促进cyp450酶基因高表达，提高罗汉果甜苷v含量。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施方案中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。需要说明的是，本文所述的罗汉果组培苗为常规组培方法得到。6-ba为6-苄氨基腺嘌呤，iba为吲哚丁酸。实施例1：一种促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将罗汉果组培苗接种于诱导培养基中诱导培养至少30天，其中，诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为50μmol/l。其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述诱导培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。诱导培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为50μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃。实施例2：一种促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将罗汉果组培苗接种于诱导培养基中诱导培养至少30天，其中，诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为400μmol/l。其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述诱导培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。诱导培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为400μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃。实施例3：一种促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将罗汉果组培苗接种于诱导培养基中诱导培养30天，其中，诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度为150μmol/l。其中，所述诱导培养基中还包括基础培养基，其配方为：ms+1.5mg/l6-ba+0.3mg/liba+3.5g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g/l活性炭。其中，所述诱导培养的条件为：相对湿度60-66％、光照强度1400lux、光照时间8h/d、温度23±2℃。诱导培养基的配制方法如下：将茉莉酸甲酯溶解于体积分数为2％的乙醇水溶液，配制成10000μmol/l的茉莉酸甲酯母液，并用0.22μm的微孔滤膜灭菌，将灭菌后的茉莉酸甲酯母液添加到基础培养基中，至茉莉酸甲酯浓度为150μmol/l，灭菌并冷却至24-26℃。实施例4：在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒5天，所述诱导液中含有浓度为50μmol/l的茉莉酸甲酯。实施例5：在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒5天，所述诱导液中含有浓度为400μmol/l的茉莉酸甲酯。实施例6：在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将经诱导培养的罗汉果组培苗移栽后，待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒诱导液至表面滴水，连续喷洒5天，所述诱导液中含有浓度为150μmol/l的茉莉酸甲酯。实施例7：在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括有0.20mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l独角金内酯。实施例8：在实施例6的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述诱导培养基中还包括有0.20mg/l油菜素甾醇和0.02mg/l独角金内酯。实施例9：在实施例3的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述组培苗经所述诱导培养之前经过根部处理，所述根部处理具体包括：将组培苗根系中根长小于最长根长度1/4的短根剪除，再将2-3条粗壮根用无菌刀分别划2-3个伤口，伤口深度小于0.2mm，再用经过预浸泡处理的玉米须包覆组培苗的根系，连续变温处理10-12次，然后将组培苗上的玉米须去除，置于100-200高斯磁场中磁化处理1h；每次变温处理均为将根系包覆有玉米须的组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min；所述预浸泡处理是指将玉米须经洗净干燥后，于30-40℃水温的预浸泡溶液浸泡处理15min，所述预浸泡溶液中含有1mg/l的纳米氧化锌、2g/l柠檬酸、3.5μg/l的天花粉、0.18g/l葡甘露聚糖，以磁化水为溶剂。实施例10：在实施例6的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述组培苗经所述诱导培养之前经过根部处理，所述根部处理具体包括：将组培苗根系中根长小于最长根长度1/4的短根剪除，再将2-3条粗壮根用无菌刀分别划2-3个伤口，伤口深度小于0.2mm，再用经过预浸泡处理的玉米须包覆组培苗的根系，连续变温处理10-12次，然后将组培苗上的玉米须去除，置于100-200高斯磁场中磁化处理1h；每次变温处理均为将根系包覆有玉米须的组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min；所述预浸泡处理是指将玉米须经洗净干燥后，于30-40℃水温的预浸泡溶液浸泡处理15min，所述预浸泡溶液中含有1mg/l的纳米氧化锌、2g/l柠檬酸、3.5μg/l的天花粉、0.18g/l葡甘露聚糖，以磁化水为溶剂。实施例11：在实施例8的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，所述组培苗经所述诱导培养之前经过根部处理，所述根部处理具体包括：将组培苗根系中根长小于最长根长度1/4的短根剪除，再将2-3条粗壮根用无菌刀分别划2-3个伤口，伤口深度小于0.2mm，再用经过预浸泡处理的玉米须包覆组培苗的根系，连续变温处理10-12次，然后将组培苗上的玉米须去除，置于100-200高斯磁场中磁化处理1h；每次变温处理均为将根系包覆有玉米须的组培苗先置于2℃下贮存1min，再置于25℃下贮存5min；所述预浸泡处理是指将玉米须经洗净干燥后，于30-40℃水温的预浸泡溶液浸泡处理15min，所述预浸泡溶液中含有1mg/l的纳米氧化锌、2g/l柠檬酸、3.5μg/l的天花粉、0.18g/l葡甘露聚糖，以磁化水为溶剂。实施例12：在实施例6的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，罗汉果组培苗移栽后，于盛花期早上6-7点摘取雄株2-3级侧蔓上的花朵，取花粉，将花粉先置于花粉浸泡液中用频率为3khz的超声波振荡器中搅拌处理2h，再经400目纱布过滤后，将纱布连同滤上物一起平摊置于带盖的玻璃器皿中，盖上设有通气孔，将带盖玻璃器皿连同花粉一起置于40℃恒温干燥机中干燥8h，密封储存于4℃下备用，授粉前将其取出置于相对湿度为85-90％的环境中吸湿24h；其中，所述花粉浸泡液中含有20g/l的蜂蜜、0.10mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l视黄酸、0.02mg/l独角金内酯，溶剂为磁化水。实施例13：在实施例11的基础上，所述的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，罗汉果组培苗移栽后，于盛花期早上6-7点摘取雄株2-3级侧蔓上的花朵，取花粉，将花粉先置于花粉浸泡液中用频率为3khz的超声波振荡器中搅拌处理2h，再经400目纱布过滤后，将纱布连同滤上物一起平摊置于带盖的玻璃器皿中，盖上设有通气孔，将带盖玻璃器皿连同花粉一起置于40℃恒温干燥机中干燥8h，密封储存于4℃下备用，授粉前将其取出置于相对湿度为85-90％的环境中吸湿24h；其中，所述花粉浸泡液中含有20g/l的蜂蜜、0.10mg/l油菜素甾醇、0.05mg/l视黄酸、0.02mg/l独角金内酯，溶剂为磁化水。为了说明本发明的技术效果，本发明的申请人针对不同方法或实施例得到的罗汉果果实，针对cyp87d18基因表达量以及甜苷v含量进行测定，具体方法以及结果如下。1、cyp87d18基因表达量测定方法：利用abi7500实时荧光定量pcr仪，采用qrt-pcr检测cyp87d18基因的表达。步骤一、样品前处理：采集罗汉果果实，挑取果肉，切成2-4mm小块并分别用锡箔纸包好，立即置于液氮中速冻，保存于-80℃备用。步骤二、先采用改良trizol法提取罗汉果果实总rna；步骤三、将rna反转录为cdna的反应体系为rna10.0μl，primescriptrtenzymemixi1.0μl，rtprimermix1.0μl，5×primescriptbuffer24.0μl，rnasefreedh2o4.0μl；反应条件为37℃(15min)→85℃(5s)→4℃；步骤四、采用primerpremier5.0软件设计引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其中，cyp87d18引物序列为：fp：gataagaatgcggccgcatgtggactgttgttttgggtt，rp：cgagctcttattcctttggagtgaactta；内参基因用ubq5，序列为fp：ataaaagacccagcaccacattc，rp：cccttgccgactacaacatcc；步骤五、qrt-pcr反应体系(20μl)为sybrpremixextaqii(tlirnasehplus)(2×)10.0μl，pcrforwardprimer(10μm)0.8μl，pcrreverseprimer(10μm)0.8μl，roxreferencedyeofdyeii(50×)0.4μl，template2.0μl，dh2o6.0μl；反应条件为95℃(30s)，接着进行40个cycles[95℃(5s)，95℃(34s)]。2、罗汉果甜苷v含量：采用高效液相色谱法，具体方法参考《广西中医学院学报》第2007年04期上发表的“hplc测定罗汉果中罗汉果甜苷v的含量”一文。对比例1：以实施例1-3的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度依次设定为：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/l，对比研究在诱导培养时间为30天时诱导培养基中茉莉酸甲酯的浓度对罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量(质量百分数)的影响，结果见表1。表1诱导培养基中茉莉酸甲酯浓度对罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量的影响茉莉酸甲酯的浓度μmol/l050100150200250300400cyp87d18基因表达量15.212.415.615.014.313.813.1甜苷v含量/(w/w％)0.701.031.692.122.091.901.821.74注：诱导培养基中不同茉莉酸甲酯浓度处理的罗汉果果实cyp87d18基因表达量以未经茉莉酸甲酯浓度处理方法得到的罗汉果果实cyp87d18基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。由表1可知，在诱导培养基中添加茉莉酸甲酯可以有效促进罗汉果果实cyp87d18基因的表达，且以150-200μmol/l时为最适宜浓度；当其浓度大于200μmol/l，随着茉莉酸甲酯的浓度增加，cyp87d18基因表达呈现一定的降低趋势。对比例2：以实施例4-6的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，将诱导液中茉莉酸甲酯的浓度依次设定为：0、50、100、150、200、250、300、400μmol/l，对比研究诱导液中茉莉酸甲酯的浓度对罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量的影响，结果见表2。表2诱导液中茉莉酸甲酯浓度对罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量的影响茉莉酸甲酯的浓度μmol/l050100150200250300400cyp87d18基因表达量15.616.918.219.217.917.217.117.0甜苷v含量/(w/w％)2.122.262.412.512.442.302.292.27注：诱导培养基中不同茉莉酸甲酯浓度处理的罗汉果果实cyp87d18基因表达量以未经茉莉酸甲酯浓度处理方法得到的罗汉果果实cyp87d18基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。由表2可知，在诱导液中添加茉莉酸甲酯，于罗汉果苗木待授粉后20-30天，每天早、中、晚于罗汉果表面喷洒，可以进一步有效促进罗汉果果实cyp87d18基因的表达，且以诱导液中茉莉酸甲酯浓度为100-150μmol/l时为最适宜浓度。对比例3：对比实施例3、实施例6、实施例7、实施例8、实施例9、实施例10、实施例11、实施例12、实施例13的促进罗汉果cyp87d18基因表达的方法，测定罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量，结果见表3。对照组设定为：以实施例3的基础上，将诱导培养基中茉莉酸甲酯浓度设为0μmol/l，其他同实施例3。表3不同实施例方法对罗汉果cyp87d18基因表达量和甜苷v含量的影响注：诱导培养基中不同茉莉酸甲酯浓度处理的罗汉果果实cyp87d18基因表达量以未经茉莉酸甲酯浓度处理方法得到的罗汉果果实cyp87d18基因表达量是1为参照；上述实验数据均为上述每一个实施方案得到的20棵罗汉果果树上任选其中5棵中得到的罗汉果果实进行平行试验得到的。实施例7与实施例8分别是在实施例3与实施例6的基础上，于诱导培养基中增加了适量的油菜素甾醇和独角金内酯，由表3可以看出，实施例7与实施例8分别相对实施例3与实施例6得到的罗汉果果实中cyp87d18基因表达量与甜苷v含量是明显增加的；实施例9、实施例10、实施例11分别是在实施例3、实施例6与实施例8的基础上，于诱导培养之前将组培苗经过根部处理，由表3可以看出，实施例9、实施例10、实施例11分别相对实施例3、实施例6与实施例8得到的罗汉果果实中cyp87d18基因表达量与甜苷v含量是显著增加的。实施例12与实施例13分别是在实施例6与实施例11的基础上，于移栽授粉前，对罗汉果雄花花粉进行处理，由表3可以看出，实施例12与实施例13分别相对实施例6与实施例11得到的罗汉果果实中cyp87d18基因表达量与甜苷v含量是显著增加的。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的实施例。当前第1页12