本发明涉及的是作物遗传育种的技术领域，尤其涉及的是一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系及其选育方法和应用。
背景技术：
花青素是植物中合成的一种水溶性天然色素，花青素是一种强有力的抗氧化剂，能为人体带来多种益处，如，能够保护人体免受自由基的损伤，增强血管弹性，改善循环系统等等。已在多种粮食作物中发现了花青素的存在，如玉米、水稻、高粱、紫薯等等。
鲜食紫、黑等彩色玉米富含花青素，因其花青素的含量高，脂肪、蛋白质、铁、钙、氨基酸等营养元素的含量丰富，被认为是鲜食玉米中的保健黄金食品。糊粉层富含花青素是彩色鲜食玉米的一种，因其f1代果实颜色分离，种子色彩丰富而备受青睐。然而，现有的大多紫色鲜食玉米品种存在上色迟缓的问题，适宜采收期色素含量低，完全上色时籽粒成熟发硬又不宜食用，导致正常采收期感官与营养品质差。另外，前人在定向培育鲜食玉米自交系时，常会出现糊粉层无花青素合成的亲本自交系，经杂交后产生果实颜色分离的f1代，对育种者造成了很大的困惑。目前，国内的彩色玉米种质资源十分有限，通过鉴定糊粉层无色的鲜食玉米自交系花青素合成的基因型，可望弥补彩色玉米种质资源匮乏的短板，充分发挥现有玉米种质资源的优势，提高彩色玉米品种的选育效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系及其选育方法和应用，旨在解决彩色玉米种质资源匮乏的短板，提高彩色玉米品种的选育效率。
本发明是通过以下技术方案实现的：
本发明提供了一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系，所述参考系包括r基因型玉米自交系和b基因型玉米自交系，所述r基因型玉米自交系为含如seqidno.1所示核苷酸序列的r基因的糊粉层无色的玉米自交系，所述b基因型玉米自交系为含如seqidno.2所示核苷酸序列的b基因的糊粉层无色的玉米自交系。
本发明还提供了上述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系的选育方法，包括以下步骤：
(1)在常规玉米种质中选择糊粉层富含花青素的玉米自交系与糊粉层无色的玉米自交系为亲本进行杂交，再连续自交七代，获得糊粉层无色的玉米自交系；
(2)利用r、b基因的核苷酸序列设计实时荧光定量pcr引物，对步骤(2)经杂交和多次自交获得的糊粉层无色的玉米自交系进行r/b基因表达量的测定，筛选获得仅携带r基因的r基因型玉米自交系和仅携带b基因的b基因型玉米自交系，即为所述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系。
进一步地，所述步骤(2)中，鉴定r基因的实时荧光定量pcr引物为：
seqidno.3：r-f：agcgacgagagaagctcaac
seqidno.4：r-r：taggctatcgtttcggcgag。
进一步地，所述步骤(2)中，鉴定b基因的实时荧光定量pcr引物为：
seqidno.5：b-f：ccatcctcgccgaaacgata
seqidno.6：b-r：tggagcccacacagactttc。
本发明还提供了一种利用上述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系鉴定玉米自交系基因型的方法，步骤包括：
将r基因型玉米自交系和b基因型玉米自交系分别与待鉴定的玉米自交系进行杂交，若：
①与r基因型玉米自交系杂交的f0代种子为紫色，与b基因型玉米自交系杂交的f0代种子为无色，则该玉米自交系为b基因型自交系；
②与r基因型玉米自交系杂交的f0代种子为无色，与b基因型玉米自交系杂交的f0代种子为紫色，则该玉米自交系为r基因型自交系；
③与r、b基因型玉米自交系杂交的f0代种子均为无色，则不属于r、b任一基因型自交系。
本发明还提供了一种利用上述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系定向培育彩色玉米品种的方法，包括以下步骤：
(i)将参考系中的两种基因型自交系分别与常规玉米种质中的糊粉层无色的玉米自交系进行测配，根据f0代玉米籽粒糊粉层颜色的呈现，判定测配玉米自交系的基因型，筛选得到基因型为r型和b型的自交系品种；
(ⅱ)将r型和b型的自交系品种进行杂交，即可得到糊粉层富含花青素的f0代种子，以及色素分离的f1代种子。
本发明还提供了一种鲜食玉米糊粉层花青素合成基因的筛选方法，包括以下步骤：
①从常规玉米种质库中选择糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系为亲本进行杂交，构建重组自交系，从重组自交系中选择糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系作为后续试验材料，并互为对照，分别提取重组自交系中糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系的授粉后30天种子糊粉层rna；
②对步骤①的rna进行高通量测序，构建重组自交系授粉后30天种子糊粉层的转录组测序文库；
③根据转录组测序文库筛选重组自交系中糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系之间的差异表达基因，并对表达有差异变化的基因的趋势进行归类，选择趋势最大的基因，利用生物信息学进行功能分析，筛选参与花青素合成调控的基因，得到r基因和b基因，所述r基因的核苷酸序列如seqidno.1所示，所述b基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。
进一步地，所述步骤②中，利用illuminahiseq2500测序平台对步骤①的rna进行高通量测序。
进一步地，所述步骤③中，对趋势最大的基因进行geneontology功能分析，筛选参与花青素合成调控的基因。
本发明的原理为：通过转录组测序、分析方法和生物信息学方法相结合，分离、鉴定出调控玉米糊粉层花青素合成的基因r与b，并通过进一步的杂交鉴定发现，只有当两个基因同时在糊粉层表达时，花青素才进行合成，否则，花青素不合成，为定向选育彩色玉米品种奠定了基础。
本发明相比现有技术具有以下优点：本发明提供了一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系选育方法和应用，本发明基于转录组测序、分析，分离、鉴定出调控玉米糊粉层花青素合成的基因r与b，结合传统杂交手段，分离出花青素无色的r基因型与b基因型玉米自交系，并以此作为参考系，对糊粉层无色的鲜食玉米自交系进行测配、鉴定。试验验证表明，利用r基因型与b基因型自交系，结合传统杂交方法，根据f0代种子花青素合成的有无，即可有效筛选、鉴定出糊粉层无色玉米自交系的花青素合成基因型，准确率达100％，可以应用于彩色鲜食玉米自交系的精准选择与新品种的培育。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1
本实施例提供了一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系的选育方法，包括以下步骤：
(1)糊粉层花青素合成调控基因的筛选
①从常规玉米种质库中选择糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系为亲本进行杂交，构建重组自交系，从重组自交系中选择糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系作为后续试验材料，并互为对照，分别提取重组自交系中糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系的授粉后30天种子糊粉层提取rna，所述rna的提取方法包括ctab法、tizol法等，均为常规提取方法，在此不做详细阐述。
②利用illuminahiseq2500测序平台对步骤①的rna进行高通量测序，构建重组自交系授粉后30天种子糊粉层的转录组测序文库。
③根据转录组测序文库筛选重组自交系中糊粉层紫色的玉米自交系和糊粉层无色的玉米自交系之间的差异表达基因，并对表达有差异变化的基因的趋势进行归类，通过曲线拟合的方法，得到趋势最大的20个基因，对该20个基因进行geneontology功能分析，得到参与花青素合成调控的r与b基因，所述r与b基因具有如seqidno.1、seqidno.2所示的核苷酸序列。
(2)糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系的构建
从安徽省农业科学院烟草研究所的玉米种子库中选择糊粉层紫色的玉米自交系6130与糊粉层无色的玉米自交系5520，作为杂交亲本，进行杂交，杂交后代再连续自交7代，获得40份糊粉层无色的玉米自交系，该40份自交系包含r基因型自交系、b基因型自交系和非r/b基因型自交系。
将该40份糊粉层无色的玉米自交系进行两两杂交，得到2份呈紫色的f0种子，进一步证明了玉米糊粉层花青素的合成不是单因素调控结果，而是两个基因共同作用的结果。
(3)糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系的筛选
利用r、b基因的核苷酸序列设计实时荧光定量pcr引物：
鉴定r基因的实时荧光定量pcr引物为：
seqidno.3：r-f：agcgacgagagaagctcaac
seqidno.4：r-r：taggctatcgtttcggcgag。
鉴定b基因的实时荧光定量pcr引物为：
seqidno.5：b-f：ccatcctcgccgaaacgata
seqidno.6：b-r：tggagcccacacagactttc。
对步骤(2)的40份自交系进行r/b基因表达量的测定，筛选获得2份携带r基因的r基因型自交系，命名为自交系6572、6591，以及1份携带b基因的b基因型自交系，命名为自交系6533，r基因型自交系和b基因型自交系共同构成鲜食玉米糊粉层花青素合成基因型参考系，该结果与步骤(2)两两杂交的结果相吻合。
(4)验证试验
将上述2份r基因型自交系与1份b基因型自交系进行杂交，获得糊粉层富含花青素的f0代种子，以及色素分离的f1代种子，进一步证实花青素合成是受r和b基因同时调控的。
实施例2
本实施例提供了一种利用糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系鉴定玉米自交系基因型的方法，其中：
1、材料来源
供试材料的来源为安徽省农业科学院烟草研究所的玉米种质库的鲜食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012与7004，其糊粉层无色。
2、方法
分别以实施例1培育的r基因型自交系6572与b基因型自交系6533为母本，以鲜食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012与7004为父本进行杂交，观察、记载f0代种子颜色；
选取鲜食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012与7004授粉后30天的种子，剥离胚与胚乳，提取皮组织的rna，反转录成cdna，利用r、b基因的引物进行扩增，检测r、b基因的表达情况。
3、结果
f0代种子颜色观察结果：
自交系7101与r基因型自交系的f0代种子紫色，与b基因型自交系的f0代无色，属于b基因型自交系；
自交系7094与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代紫色，属于r基因型自交系；
自交系7088与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代紫色，属于r基因型自交系；
自交系7062与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代无色，不属于r、b基因型自交系；
自交系7056与r基因型自交系的f0代种子紫色，与b基因型自交系的f0代无色，属于b基因型自交系；
自交系7044与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代无色，不属于r、b基因型自交系；
自交系7033与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代无色，不属于r、b基因型自交系；
自交系7012与r基因型自交系的f0代种子无色，与b基因型自交系的f0代无色，不属于r、b基因型自交系；
自交系7004与r基因型自交系的f0代种子紫色，与b基因型自交系的f0代无色，属于b基因型自交系；
实时荧光定量pcr验证结果：
自交系7101中有b基因的表达，属于b基因型自交系
自交系7094中有r基因的表达，属于r基因型自交系；
自交系7088中有r基因的表达，属于r基因型自交系；
自交系7062中无r、b基因的表达，不属于r、b基因型自交系；
自交系7056中有b基因的表达，属于b基因型自交系；
自交系7044中无r、b基因的表达，不属于r、b基因型自交系；
自交系7033中无r、b基因的表达，不属于r、b基因型自交系；
自交系7012中无r、b基因的表达，不属于r、b基因型自交系；
自交系7004中有b基因的表达，属于b基因型自交系。
结论：参考系与待测品种测配结果与实时荧光定量pcr验证结果完全一致，测配检测准确率为100％。
实施例3
本实施例提供了一种利用所述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系定向培育彩色玉米品种的方法，包括以下步骤：
(i)按照实施例2所述方法验证鲜食玉米自交系7101、7094、7088、7062、7056、7044、7033、7012与7004的基因型，得出：自交系7101、7056、7004为b基因型自交系，自交系7094、7088为r基因型自交系。
(ⅱ)将自交系7101、7056或7004与自交系7094或7088进行杂交，得到糊粉层富含花青素的f0代种子，以及色素分离的f1代种子。
实施例4
本实施例提供了另一种利用所述糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系系定向培育彩色玉米品种的方法，包括以下步骤：
(i)在常规玉米种质库中选择糊粉层紫色的玉米自交系糊粉层无色的玉米自交系作为亲本进行杂交，杂交后代再连续自交6-7代，获得糊粉层无色的玉米自交系。
(ⅱ)按照实施例2所述方法验证步骤(i)获得的糊粉层无色的玉米自交系的基因型，筛选r基因型自交系品种和b基因型自交系品种。
(ⅲ)将r基因型自交系品种和b基因型自交系品种进行杂交，得到糊粉层富含花青素的f0代种子，以及色素分离的f1代种子。
以上为本发明一种详细的实施方式和具体的操作过程，是以本发明技术方案为前提下进行实施，但本发明的保护范围不限于上述的实施例。
sequencelisting
<110>安徽省农业科学院烟草研究所
<120>一种糊粉层花青素合成型鲜食玉米参考系及其选育方法和应用
<130>/
<160>6
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>2211
<212>dna
<213>zeamays
<400>1
gcagggatatgtacacgtacgtacaaaagtgaattgaagcagctagcagcaacgagccac60
atatccttccttcttcttcctggtggctctggctgtgtagagctgctggttactacatgt120
cgtctcgtctgtctgatgccatgtcgctgtagtgttcgatggaaagcaccaattaaagtg180
gaaccggcgtggggccctcgccatggaaaccccggccaatgcaacggaaggaacgaagtg240
tcattgtgaggccttgcatgctgcttgcttgcttaataatctgggggtgggggtgggatc300
gatccctcaggaagctaagcatcaatcagagagagagagagaaattcacgcgatggtgat360
tattcgattaaacaaccggcgcccccgccgacgaagagtgaaggaggcagaagcccggcg420
ctagctagctactagagaggagaggagccgacggccccggggagggagagagagagagag480
actgagagagagaggtcgtgttaaaagccctactataaacaccaaccagccatttgcacc540
cagcaacgtacagctagctagcaggcagcagcacatagcctccgattattcagctggagg600
tcggtctgtgtgtgcgtgcatggggcatcactcctgctgcaaccagcagaaggtgaagag660
ggggctctggtcccctgaggaggacgagaagctcatcaggtacatcaccacccatggcta720
cgggtgctggagcgaggtccccgagaaggccggcctacaacgctgcgggaagagctgccg780
gctgcggtggatcaactacctcaggccggacatccgccgaggccggttcacggcggagga840
ggagaagctcatcatcagcctgcacgccattgttggcaacaggtgggcccacattgccag900
ccacttgcccgggcggacggacaacgagatcaagaactactggaactcgtggatcaagaa960
gaagatccggaagccggcgatgagcacgacgacgacgagctcggccgtgacggcggcgag1020
ccctccgtgcagcacggcggcgtcggacgcggcgcttggtcgtcacctgcagacgccgtt1080
cagcgcggcggagcaccggctcgacgccatcctcagccagagccttgccttgccgccgcc1140
gaagctgggctccggcggcggcggcggcggcggccaagagtccccgccgctgcccccgca1200
ctgccccttcttcatgttcgacacgagcgtcagcgtcagcccgccgtcgcccgcggccgc1260
tgcagcacaccacctgcagcacccgttcctcactttcacggcggcggcgatggacgacaa1320
cgcgccgatgggcttccatctgccgcccttggtggacggcatgggaatgggcatgccagc1380
agccatggactgcggcgctctaggccatgaccaccgcgttgccggcggcaacaacaatgg1440
tcaggcggcggcggcggcggccggcatggcgaacggctgctgctacgggcagctgcagaa1500
gcagcaggaggaggagcagcagccgtcgctggggcaggaggaccagtgggacgacgagtc1560
ggcgcggcacctgctgatgtgggacgatgaccaagaactaacaccgtccaacctggaagc1620
catggaaagtacagctcactccctcctttttatgggaccaaatgaccatacatgacgaaa1680
aagctagcttattattggtgtgcatgcgcatctatccccctctcttcttgatctgatctg1740
ctacctctagctctctcacccgatctgctgatctgtgtccatacatgcaataatgaggtt1800
gttgtccaaggagcataatttatttttgctggatttttcatttttctcatattgatttaa1860
cctttattttttttggtttttggtttgggctttgtggagtgaattgaagactaaaaggct1920
aagagtgtgcgtgttaaatggggttttattttttgtaaagaggatttgcatgctcttgca1980
tggcgttgcgcttggagtgtaatttgattgatgtatctaagtgaatttaaaataaggaag2040
atgacactaaaagagatcgaaagggagtcacgcaccccttttccactttgggtgcttgct2100
gtgtttgtttgctccatagattgcgcatgcgtatgtggatgtcgacgtggatggatgtac2160
ctaagctagctagccatgcatcaacaactatcttggccgtaagcatccaat2211
<210>2
<211>1876
<212>dna
<213>zeamays
<400>2
ggcagcctcctcccccaacccaagtctctctctctctcccaaaccaaaagaaggcttcca60
cttccagctgcagcggagcatcgccagttcagagttcaccaccacgcctttgacctccag120
cccatagcccaatcccgcaagcatccatccacgcccaccgcacccgctataaaatctccc180
cctctgctcccgattcgccacctaaaggaggcgcctttccccaaatccaccaccaccgag240
aaacaaccgcaggaaatccgctcggccctcggctccggtcactctgttgcggccacgatg300
aaagagggcagacccggcgccggcgactacattgccagcctgctaagctcgtcgccgagg360
ctcgacttcggcggggaggaggaggaggactgcctggacaggttctgcggcgacccgggg420
ttcgcggctcgcgcggcgcggctgtccagcttcagcgggcagcgcttcgccgtcaccgcg480
ggcctcttcgggctgcccccgccgctgcccgccgcgagcggcggcggcgagttcgccggg540
tcccgggaggcgtcgtcggtgtcggacccggcgtcggcgatgaaggacgccaatgccaag600
aagcggaaggcgcccgcggcggcggcggccaagggcaaaggcagggagccatctgcgcag660
gcacaggcaggggagccgaagggtccggacgccaagaggtgctgcaaggcggagggaggc720
gagggggaggaggggagccccgtgaagctgcccaagccggagcaggccggcagcgacagc780
tccgtcgaggacggcggcgcgcagaaccagaagccgccgccgccggtgaagggaaagaat840
gccaagccggtggagcctcccagggactacgtccatgtccgggccaggagagggcaggct900
accgacagccacagcctcgcagagagggtgagaagggagaggatcagccagaggatgaag960
gtccttcaggacctggtgccaggatgcaacaaggtgatcggcaaggcgctgatgctcgac1020
gagatcataaactacgtgcagtcgctgcaacggcaggtcgagttcctctccatgaagctc1080
gcaaccgtcaacccactggacctgagcaacctgcccacgctcctacaaaaagatatgttc1140
caggcctgcggcgcttcggcgagctcggtcttctcgctggagagctgcagcccggggttc1200
ccgttcggcgggcaaggggacgtgttccagtccttcgtcccgaacggcctggagaacccg1260
tgcggcggcctgaacccgctggacctggctctgtcccaggctaccggcgggcagttcggt1320
ttccaggacggaacggccggcacaaacctgcagcaaaggaactactgggaggaggaggag1380
gaggacctgcagagcgtgttccacatcgacgacaacgggcagagccaggagcacggggcc1440
tcagcttcagcacaaagcttccatggtcagcttcaaccacaagagggccacatgaagatg1500
gagttcttctgatcgggcctcgacacccagccgccgacggccgagggagcgacctgtaca1560
tagcgaagactcgaggtacaagtacaaaagcaccagcggcggtggcggcggcggggacgg1620
aagctctgaagctatagctaacagcaagtccgtacatgtaggcccttccttgcccttgga1680
gaggcgagttcttcgctcgccgtagcgtgaaccagggggtgggcgatcgtgtgatttctt1740
tgaacgttttcgatccggcgattaatttgattgattaacacagccaccccgacgatagcg1800
tacgtagcaatcacccgaacagtgaagctgtcacttttgtgtataagataatgcatatgg1860
tgcagatattagtatc1876
<210>3
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>3
agcgacgagagaagctcaac20
<210>4
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>4
taggctatcgtttcggcgag20
<210>5
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>5
ccatcctcgccgaaacgata20
<210>6
<211>20
<212>dna
<213>人工序列
<400>6
tggagcccacacagactttc20