本发明涉及植物提取领域，尤其涉及小叶九里香枝干抑菌活性成分的分离方法以及抑菌剂。
背景技术：
：：随着人们对生态平衡和绿色健康概念越来越重视，环境和食品安全成为当前全社会关注的两大主要问题，而化学农药导致的农残超标、环境污染及抗性等问题则成为社会关注的焦点。因此，开发能有效控制有害生物的高效、低毒、低残留的绿色低碳环保型新剂型，已经成为农药创制研究的首要目标。植物源农药因具有诸如易降解、不污染环境、安全间隔期短及不易产生抗药性等优点而成为农药研究与开发的热点之一。而从植物源农药找到新的对环境友好型的活性先导化合物是植物源农药研究的一个主要方向，是我们目前解决病虫害防治的主要手段，一直都处在重要的研究位置。九里香属植物的化学成分和药理作用的研究一直是国内外研究的热点。20世纪80年代，国内外学者对九里香属植物的根茎进行了十分深入系统的化学成分研究，主要的化学成分包含香豆素类、黄酮类、生物碱类、挥发油类以及甾体等多种化合物，并以香豆素类和黄酮类的研究为多，目前国内外对九里香属植物的药理作用的研究也主要应用在医学上看细胞活性的研究，关于农业应用活性方面只有零星的报道。小叶九里香(murrayamicrophylla)为芸香科九里香属植物小叶九里香的干燥枝叶，主要分布在中国台湾、广东、海南、广西等地。民间用其枝叶入药，有祛风活血、消炎止痛作用。前期研究发现，小叶九里香甲醇提取物具有很好的杀菌活性。经广泛的文献查阅发现，目前国内外对小叶九里香化学成分的研究不多。冯小飞等对小叶九里香香豆素类化合物进行了研究，结果分离到19种香豆素类，5种黄酮类，2种生物碱类化合物。冯小飞.小叶九里香香豆素类化合物研究[d].云南大学,2013.杨崇仁等对小叶九里香咔巴唑类生物碱化学成分进行了研究，分离鉴定了4种化合物。邹联新,杨崇仁,郑汉臣,等.小叶九里香咔吧唑类生物碱化学成分研究[j],中药材,1999,22(9):458-460.邹联新等对海南三亚产小叶九里香中挥发油成分进行了研究，分离鉴定出22个萜类化合物。邹联新,郑汉臣,杨崇仁,等.小叶九里香叶挥发油成分分析[j].中药材,1998,21(11):569-571.目前针对小叶九里香的生物活性的研究也主要在医药方面，农用杀菌活性方面的研究不多。喻大昭等研究结果表明，九里香叶的提取物对部分真菌有较显著的抑菌作用；喻大昭,杨小军,杨立军,等.植物提取物对植物病原真菌的抑菌活性研究[j].湖北农业科学,2001(5):49-51.骆焱平等对128种南药植物提取物的抑菌活性初筛，发现九里香的丙酮提取物有很好的抑菌效果。骆焱平,郑服丛,杨叶,等.128种南药植物提取物对6种病原菌的生长抑制作用[j].热带作物学报,2004,25(4):106-111.但还没有关于具体是哪种或哪几种化合物有较好抑菌效果研究的报道。因此，有必要对其进行系统的化学成分和农用生物功能评价研究，这将对更好、更广泛的利用小叶九里香起到非常积极的作用。为了顺应绿色农药的发展趋势，开发有效控制有害生物的高效、低毒、低残留绿色低碳环保型新剂型，实现农药创制研究。我们选定具有诸如易降解、不污染环境、安全间隔期短及不易产生抗药性等优点的植物源农药这一农药研究与开发的热点。本研究旨在前人的基础上，利用海南植物资源丰富的优势，通过向当地农民、药农实地调查，对采集到的中药材小叶九里香进行分离，对于分离出的化合物进行结构鉴定，进而对鉴定的化合物进行活性筛选和活性评价，建立起这类化合物的杀菌活性的评价体系，并通过活性对比初步判断每个分子结构的活性基团，为进一步的化学合成和结构改造奠定基础。研究结果无论是对植物源农药的合理利用，还是对农药先导化合物的发现及指导化学合成或结构修饰优良的农药化合物都具有重要意义，顺应当今环境保护和食品安全对农药的需求。植物真菌性病害一直是作物生产和产品贮藏过程中主要的制约因素之一，对于产品的发育阶段、营养价值、有限保质期等质量问题方面都造成了严重的损失。目前，植物性真菌还是主要由化学的杀菌剂控制，然而，由它们可以导致抗性、毒性残留等问题，使得这些化学物质的应用越来越受到限制。植物可以合成不同类型的次生代谢产物，其中一些参与植物保护，抵御病原体的侵袭。并且这些次生代谢产物具有自然地可降解的可再生的特性，越来越受到人们的关注。广泛的研究表明，来自植物的天然产物的次生代谢产物的可以有效地降低植物性真菌的损害，从而改善植物疾病和保护储存产品。为了提高产量，提供健康的农作物和食品，植物天然产物的次生代谢产物成为新型无抗性杀菌剂有待进一步研发。我国人口众多，粮食问题是我们亟待解决的重要问题，而我国主要的粮食作物是水稻和小麦。水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)在这两种粮食作物中作为代表性病害真菌成为我们选择的对象；此外，我们还选择了在蔬菜中常见的3种病原菌，油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)和茄孢镰刀菌(fusariumsolani)、番茄早疫病菌(alternariasolani)作为我们的作用对象；香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)、胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)作为亚热带水果和作物的代表性真菌也被列为我们研究的对象。技术实现要素：发明的目的：为了提供一种效果更好的小叶九里香枝干抑菌活性成分的分离方法以及抑菌剂，具体目的见具体实施部分的多个实质技术效果。为了达到如上目的，本发明采取如下技术方案：一种抑菌剂，所述抑菌剂为如下(a)-(c)物质的任意一种或者多种的组合，咔吧唑生物碱类、萜类或者1种长链脂肪烃类化合物中的任意一种或者多种的组合在制备抑菌剂中的用途。小叶九里香枝干抑菌活性成分的分离方法，其特征在于，分离步骤(方法)：将小叶九里香枝干剪成小段、阴干、粉碎、甲醇提取、最后经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇系列萃取；取石油醚和氯仿部位采用反复柱层析和重结晶的方法进行分离纯化；提取分离方法(步骤)具体实施方式：小叶九里香(8kg)用甲醇溶剂(12l,3次重复)在分液漏斗中进行萃取；于40℃减压蒸发得甲醇提取物(882g)；将甲醇提取物悬浮于4l蒸馏水中，加入石油醚(4l；3次重复)萃取；水溶液层以同样的方法用氯仿萃取；在减压下蒸发，产生石油醚部位(112.2g)和氯仿部位(39.6g)；石油醚部位(112.2g)经40g的粗硅胶(60-80目)拌样，于1500g的细硅胶(200-300目)柱分离，洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯系统，以体积比为(100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100)比例进行梯度洗脱；再以乙酸乙酯-甲醇系统，以体积比为(9:1,5:5,)洗脱，最后以纯甲醇清洗柱子。分别对每个流分采用反复的凝胶(sephadexlh-20)柱层析和重结晶，先后得到纯化的化合物，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；氯仿部位(39.6g)经10g的粗硅胶(60-80目)拌样，于450g的细硅胶(200-300目)柱分离，洗脱剂采用石油醚-丙酮系统和丙酮-甲醇系统，以同样的方法得到纯的化合物，于4℃冰箱保存待进行进一步的结构分析和活性评价；得到化合物。一种新型食品添加剂或者防腐剂，其特征在于，其为如上所述的(a)-(c)物质的任意一种或者多种的组合。如上所述的(a)-(c)物质的任意一种或者多种的组合在制备防治水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、番茄早疫病菌(alternariasolani)、香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)、胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)和茄孢镰刀菌(fusariumsolani)引起的疾病的药物中的用途。如上所述的(a)-(c)物质的任意一种或者多种的组合在制备防治水稻稻瘟病菌病害的药物中的用途。采用如上技术方案的本发明，相对于现有技术有如下有益效果：本发明从小叶九里香的根茎中共分出11种化合物，包含7种咔吧唑生物碱类、3种萜类和1种长链脂肪烃类化合物，广泛的活性筛选结果：就测试化合物而言，a，b和c这3个系列的咔吧唑生物碱对于测试的8种植物性病原菌表现出不同程度的抗菌活性，尤其girinimbine和murrayanine具有抑菌广谱性，特别是murrayanine完全抑制了8种病原菌的生长，相比与其它化合物，其具有更好的抗菌性能；就测试菌种而言，茄孢镰刀菌(fusariumsolani)仅对murrayanine表现出良好的敏感性，而水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)和胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)均可以被这三个系列的化合物很好的抑制，尤其是针对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)。就本活性筛选的整体而言，我们的直接结果表明murrayanine和girinimbine对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)有更好的抑制效果(抑制率分别为92％和48％)，我们有必要针对murrayanine对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)的抑菌活性做进一步的毒力测定，结果表明murrayanine对水稻稻瘟病菌的毒力呈现一个清晰的剂量-效应关系，ec50值为65.811μg/ml，具有较好的抑制作用，本发明建议murrayanine可以直接作为药剂作用于水稻稻瘟病菌病害的作物。本发明通过对小叶九里香枝干化学成分并研究其抑菌活性的研究，发现了这些化学成分作为绿色的天然源性作物杀菌剂或者产品添加剂或者食品防腐剂，可以用以保护蔬菜、水果和作物免受植物源性真菌，尤其是水稻稻瘟病菌的侵害。附图说明为了进一步说明本发明，下面结合附图进一步进行说明：图1为table1；表1从小叶九里香分离到的11个化学成分对8种测试菌株的抑制率(测试浓度在200μg/ml)table1theinhibitionofelevenchemicalcompositionsfromm.microphyllawiththeconcentrationat200μg/mlagainsteighttestedfungi.注：-表示无抗菌活性，+表示有抗菌活性，其他抗菌活性数据均用三次重复的平均值±标准误表示。1：水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)；2：番茄早疫病菌(alternariasolani)；3：香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)；4：芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)；5：胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)；6：小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)；7：油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)；8：茄孢镰刀菌(fusariumsolani)。图2为table2；注：表中y为机率值，x为浓度对数。测定结果表明(表2)，murrayanine对水稻稻瘟病菌的毒力呈现一个清晰的剂量-效应关系，ec50值为65.811μg/ml，具有较好的抑制作用。murrayanine对水稻稻温病菌菌丝生长的抑制情况，化合物浓度依次为200，150，100，50，25μg/ml，结果见表2。95％置信限/(μg/ml)；图3到图13为分离出的物质的结构图；图14为a类物质的结构示意图；图15为b类物质的结构示意图；图16为c类物质的结构示意图。具体实施方式下面结合附图和具体实施方式，进一步阐明本发明，应理解下述具体实施方式仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。化合物murrayanine的提取及应用。从小叶九里香枝干分离得到7个咔吧唑生物碱，3个萜类和1个长链脂肪烃，咔吧唑生物碱是其主要成分。2,4-11系从该植物中首次分离。1.此次发明技术就是获得一系列具有活性的咔吧唑生物碱类化合物，尤其是murrayanine的方法步骤及抗菌活性的实验步骤。2.此发明技术就是对咔吧唑生物碱这类化合物可以作为潜在的作物杀菌剂、产品添加剂和食品防腐剂，以保护蔬菜、水果和作物等产品免受植物源性真菌的侵害这一农业应用的保护。3.此发明技术的更深远的目的是对发现的活性物质进行其特有的结构及其潜在有活性侧链的保护，以便发明人进行进一步地研究(制剂方面，化学结构修饰合成方面)。一种小叶九里香枝干化学成分的提取方法，包括以下步骤：将采回的小叶九里香枝叶分开，得到12.00kg枝干的鲜重，剪成小段，先于阴凉处晾干，再置于烘箱中烘干(50℃，24h)，粉碎机粉碎成粉末(8.30kg)。以10倍量甲醇避光冷浸提取3次，每次3d，过滤，45℃减压浓缩并回收溶剂，经真空干燥得小叶九里香粗提物总浸膏。小叶九里香的粗提物的萃取流程图见图1。将浸膏悬浮于5倍量蒸馏水混匀，形成黄棕色溶液，依次加入3倍量的石油醚沸点(60-90℃)、三氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇，反复摇匀，及时放气，避免分液漏斗压力过大。静置0.5h-1h，待分层后进行萃取。每相萃取过程重复3次，分别合并萃取液，45℃减压浓缩并回收溶剂，经真空干燥得到小叶九里香石油醚部位112g、三氯甲烷部位40g、乙酸乙酯部位20g、正丁醇部位4g。将4种萃取相密封，4℃保存备用。石油醚部位(112.2g)经40g的粗硅胶(60-80目)拌样，于1500g的细硅胶(200-300目)柱分离，洗脱剂采用石油醚-乙酸乙酯系统，以体积比为(100:0，99:1，98:2，96:4，92:8，90:10，88:12，85:15，83:17，80:20，75:25，70:30，65:35，60:40，50:50，30:70，0:100)比例进行梯度洗脱；再以乙酸乙酯-甲醇系统，以体积比为(9:1,5:5,)洗脱，最后以纯甲醇清洗柱子。分别对每个流分采用反复的凝胶(sephadexlh-20)柱层析和重结晶，先后得到纯化的化合物，于4℃冰箱保存待进一步的结构分析和活性评价。氯仿部位(39.6g)经10g的粗硅胶(60-80目)拌样，于450g的细硅胶(200-300目)柱分离，洗脱剂采用石油醚-丙酮系统和丙酮-甲醇系统，以同样的方法得到纯的化合物，于4℃冰箱保存待进一步的结构分析和活性评价。从小叶九里香茎和根中共分离得到11个化合物，分别为koenidine(化合物1)、koenimbine(化合物2)、girinimbine(化合物3)、mahanimbine(化合物4)、murrayanine(化合物5)、mukonal(化合物6)、murrayaquinone-b(化合物7)、7-oxysitosterol(化合物8)、β-sitosterol(化合物9)、daucosterol(化合物10)、hexacosanoicacid(化合物11)。结构鉴定化合物1白色针晶，化学式为c20h21no3。1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：10.89(1h,s,n-h),7.60(1h,s,h-12),7.51(1h,s,h-6),6.95(1h,s,h-3),6.88(1h,d,j＝9.8hz,h-14),5.77(1h,d,j＝9.8hz,h-15),3.83(6h,d,j＝6.6hz,-och3),2.23(3h,d,j＝0.8hz,11-ch3),1.42(6h,s,16-ch3)；13c-nmr(dmso-d6,101mhz)δ：148.44(c-2),148.10(c-10),144.10(c-1),135.33(c-4),134.86(c-8),129.33(c-15),120.56(c-12),118.44(c-11),116.82(d,j＝56.9hz,c-5),115.37(c-14),104.73(c-9),103.43(c-6),99.99(c-7),95.37(c-3),75.85(c-16),56.69(2-och3),56.18(1-och3),27.86(16-ch3),27.68(16-ch3),16.38(11-ch3)。鉴定为koenidine，化学式参见图3。化合物2:白色针晶，分子式为c21h23no4。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：7.69(1h,s,h-12),7.61(1h,s,h-6),7.40(1h,d,j＝2.5hz,h-3),6.93(1h,dd,j＝8.7,2.5hz,h-2),6.55(1h,d,j＝9.8hz,h-14),5.64(1h,d,j＝9.7hz,h-15),3.89(3h,s,-och3),2.32(3h,d,j＝0.9hz,11-ch3),1.47(6h,s,16-ch3)；13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：154.03(c-1),149.89(c-10),135.80(c-8),134.45(c-4),129.29(c-5),124.51(c-15),121.11(c-12),118.39(c-11),117.28(c-14),116.92(c-2),113.09(c-3),111.10(c-6),104.57(c-9),102.71(c-7),75.92(c-16),56.10(1-och3),27.67(16-ch3),27.67(16-ch3),16.13(11-ch3)。鉴定为koenimbine，化学式参见图4。化合物3白色针晶，分子式为c18h17no。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ:7.92–7.88(1h,m,h-6),7.81(1h,s,h-12),7.66(1h,s,h-3),7.34(1h,dt,j＝8.1,1.1hz,h-2),7.17(1h,ddd,j＝8.0,6.9,1.3hz,h-1),6.57(1h,d,j＝9.7hz,h-14),5.66(1h,d,j＝9.7hz,h-15),2.33(3h,d,j＝0.8hz,18-ch),1.47(s,6h,16-ch3)；13c-nmr(dmso-d6,101mhz)δ:149.85(c-10),139.54(c-4),134.88(c-8),129.45(c-15),124.35(c-5),123.99(c-2),,121.23(d,j＝3.0hz,c-6),120.18–118.97(m,c-12),118.67(c-1),117.29(d,j＝3.2hz,c-11),116.82(c-14),110.50(d,j＝2.9hz,c-3),104.51(c-9),99.98(c-7),75.95(c-16),27.69(d,j＝3.1hz,16-ch3),27.58(16-ch3),16.19(11-ch3)。鉴定为girinimbine，化学式参见图5。化合物4白色针晶，分子式为c23h25no。1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ:7.90(1h,dd,j＝7.8,1.1hz,h-6),7.83(1h,s,h-12),7.65(1h,s,h-3),7.38–7.31(1h,m,h-2),7.16(1h,ddd,j＝7.9,7.0,1.2hz,1ht,h-1),6.62(1h,d,j＝9.8hz,h-14),5.64(1h,d,j＝9.8hz,h-15),5.11(1h,dddd,j＝7.2,5.8,2.9,1.4hz,1hm,h-3′),2.33(3h,s,d,j＝0.8hz,11-ch3),2.16(2h,p,j＝7.6hz,h-c2′),1.83–1.71(2h,m,h-2′),1.65(3h,d,j＝1.4hz,4′-ch3),1.57(3h,d,j＝1.2hz,4′-ch3),1.44(3h,s,16-ch3)；13c-nmr(dmso-d6,101mhz)δ:145.18(10-c),134.71(4-c),130.12(8-c),126.97(4′-c),123.79(15-c),119.48(3′-c),119.46(5-c),119.19(2-c),116.47(6-c),114.74(12-c),114.57(1-c),113.70(11-c),112.79(14-c),111.88(3-c),105.65(9-c),99.47(c-7),73.44(16-c),36.05(1′-c),21.12(16-ch3),20.97(4′-ch3),18.04(c-2′),12.87(4′-ch3),11.38(11-ch3)。鉴定为mahanimbine，化学式参见图6。化合物5黄色针晶,分子式为c14h11no2。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：10.04(1h,s,-cho),8.69(1h,s,n-h),8.17(1h,dd,j＝1.3,0.6hz,h-12),8.09(1h,dq,j＝7.8,0.9hz,h-6),7.51(1h,ddd,j＝8.2,1.6,0.8hz,h-2),7.48(1h,dd,j＝6.7,1.2hz,h-3),7.45(1h,d,j＝1.2hz,h-10),7.31(1h,ddd,j＝8.0,6.6,1.5hz,h-1),4.04(3h,s,-och3).13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：191.96(11-cho),146.11(c-9),139.48(c-4),134.13(c-11),130.16(c-8),126.66(c-5),123.69(c-2),123.65(c-6),120.73(c-1),120.72(c-12),120.45(c-3),111.56(c-10),103.53(c-7),55.82(9-och3)。鉴定为murrayanine，化学式参见图7。化合物6黄色针晶，分子式为c13h9no2。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：10.43(1h,s,-cho),8.39(1h,s,h-12),7.97(1h,d,j＝7.8hz,h-6),7.42(1h,d,j＝7.7hz,h-3),7.38(1h,dd,j＝7.0,1.1hz,h-2),7.34–7.12(1h,m,h-1),6.78(1h,d,j＝9.9hz,h-9),5.77(1h,d,j＝9.9hz,-oh)；13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：189.93(d,j＝4.8hz,-cho),154.81(c-10),141.17–140.97(m,c-8),140.74(c-4),129.57(c-12),125.76(c-5),123.81(c-2),120.38(c-6),120.03(c-1),119.69(c-7),116.65(c-11),110.85(c-3),104.18(c-9)。鉴定为mukonal，化学式参见图8。化合物7棕红色针晶，分子式为c19h19no3。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：9.16(s,1h,n-h),8.01(1h,d,j＝8.8hz,h-6),7.04(1h,d,j＝8.8hz,h-10),6.44(1h,dt,j＝2.3,1.1hz,h-1),5.25(1h,t,j＝7.1hz,h-19),3.91(3h,s,2-och3),3.58(2h,d,j＝7.0hz,h-18),2.14(2h,d,j＝1.6hz,1′-ch2-),1.74(3h,s,4′-ch3),1.25(3h,s,5′-ch3)；13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：183.77(c-12),179.92(c-9),156.03(c-2),148.20(c-4),138.01(c-10),135.15(c-11),133.87(c-8),131.53(c-16),121.61(c-7),121.10(c-15),119.03(c-5),117.25(c-6),112.67(c-3),110.80(c-1),56.70(2-och3),25.71,23.71,18.04(c-2′),16.13(4′-ch3)。鉴定为murrayaquinone-b，化学式参见图9。化合物8白色晶体，分子式为c29h48o2。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：5.69(1h,d,j＝1.8hz,h-6),3.68(1h,tt,j＝11.2,4.4hz,h-3α),1.20(3h,s,19-ch3),0.93(3h,d,j＝6.5hz,21-ch3),0.85(3h,dd,j＝6.8,1.7hz,29-ch3),0.82(3h,d,j＝1.7hz,26-ch3),0.81–0.76(3h,m,3h,27-ch3),0.68(3h,s,18-ch3)；13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：202.40(c-7),165.19(c-14),126.13(c-6),70.54(c-3),54.73(c-17),49.97(d,j＝3.1hz,c-9),45.85(c-24),45.45(c-8),43.13(c-13),41.85(c-4),38.73(c-12),38.32(c-10),36.38(c-1),36.12(c-20),33.97(c-22),31.22(c-2),29.15(c-25),28.59(c-16),26.36(c-15),26.11(c-23),23.08(c-28),21.25(c-11),19.84(c-26),19.08(c-27),18.96(c-21),17.35(c-19),12.01(c-18),12.01(c-29)。鉴定为7-oxysitosterol，化学式参见图10。化合物9白色晶体,化学式为c29h50o。1h-nmr(chloroform-d,400mhz)δ：5.35(1h,dt,j＝5.4,2.0hz,h-6),3.53(1h,tdd,j＝11.1,5.3,4.1hz,h-3),1.01(3h,s,19-ch3),0.94–0.91(3h,m,21-ch3),0.85(3h,d,j＝7.5hz,29-ch3),0.82(3h,d,j＝1.9hz,26-ch3),0.82–0.76(3h,m,27-ch3),0.68(3h,s,18-ch3)；13c-nmr(chloroform-d,101mhz)δ：140.76(c-5),121.76(c-6),71.85(c-3),56.80(c-14),56.09(c-17),50.16(c-9),45.87(c-24),42.36(c-13),42.28(c-4),39.81(c-12),37.29(c-1),36.54(c-10),36.19(c-20),33.98(c-22),31.95(c-7),31.94(c-8),31.65(c-2),29.19(c-25),28.29(c-16),26.11(c-23),24.34(c-15),23.11(c-28),21.13(c-11),19.87(c-26),19.44(c-19),19.08(c-27),18.82(c-21),12.03(c-18),11.90(c-29)。鉴定为β-sitosterol，化学式参见图11。化合物10白色晶体，分子式为c35h60o6。1h-nmr(dmso-d6,400mhz)δ：5.33(1h,d,j＝4.9hz,h-6),4.92–4.86(m,3h,glc-6,glc-5,glc-2),4.44(t,j＝5.8hz,1h,glc-1),4.22(d,j＝7.8hz,1h,glc-6),3.68–3.61(m,1h,glc-6-oh),3.50–3.43(m,1h,glc-3),3.43–3.37(m,1h,glc-4-oh),3.33(s,1h,glc-3-oh),3.33–3.30(m,1h,glc-2-oh),2.89(ddd,j＝8.9,7.8,4.8hz,1h,h-3),2.40–2.34(m,1h,h-4),0.96(3h,s,h-19),0.90(3h,d,j＝6.4hz,h-21),0.84–0.82(3h,m,h-29),0.81(3h,d,j＝1.6hz,h-27),0.79–0.74(3h,m,h-26),0.65(3h,s,h-18)；13c-nmr(dmso-d6,101mhz)δ：140.92(c-5),121.68(c-6),101.27(glc-1),79.98–78.73(m,c-3),77.40(glc-3),77.24(d,j＝2.8hz,glc-5),73.94(glc-2),70.58(glc-4),61.58(glc-6),56.66(c-14),55.91(c-17),50.09(c-9),45.63(c-24),42.34(c-13),38.80(c-12),38.63(c-4),37.32(c-1),36.70(c-10),35.97(c-20),33.83(c-22),31.91(c-7),31.86(c-8),29.75(c-2),29.19(c-25),28.28(c-16),25.92(c-23),24.35(c-15),23.09(c-28),21.08(c-11),20.20(c-27),19.59(c-18),19.42(c-26),19.10(c-21),12.27(c-19),12.16(c-29)。鉴定为daucosterol,化学式参见图12。化合物11：白色片状结晶，分子式为c29h52o2。1h-nmr(400mhz,chloroform-d)δ：2.35(t,j＝7.5hz,2h),1.63(p,j＝7.4hz,2h),1.25(s,42h),0.92–0.83(m,3h)；13c-nmr(101mhz,chloroform-d)δ：179.72(c-1),34.02(c-2),31.97(c-24),29.8-29.1(c-23～c-4),24.72(c-3),22.73(c-25),14.16(c-26)。鉴定为hexacosanoicacid，化学式参见图13。抗菌测试菌种:水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、番茄早疫病菌(alternariasolani)、香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)、胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)、小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)、油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)和茄孢镰刀菌(fusariumsolani)。抗菌筛选的具体实施方式:本研究选用了常见的且危害极高的8种植物病原菌种作为受试对象，采用菌丝生长速率抑制法对分到的11个化合物进行体外抗植物病原菌活性的测定。为了克服化合物的溶解性问题，测试物先溶用丙酮-吐温-80混合溶剂(丙酮：吐温-80为3:1)超声溶解，然后用无菌水稀释至2000μg/ml，分别取5ml上述溶液和45ml的无菌pda培养基倒入90mm的培养皿中，最终的测试物的浓度为200μg/ml，丙酮-吐温-80混合溶剂则不超过2％，再分别以同样量的无菌水、丙酮-吐温-80混合溶剂作为空白对照和溶剂对照，并将待测菌株反接于培养皿的中心，于25℃培养箱内放置，每组处理重复三次。在1-4天后测试每个菌株的菌落直径(mm)和原菌丝的接种直径(5mm)，抑制率由如下公式计算：i(％)＝(c-t)/(c-5)×100；i＝菌丝生长抑制率；c＝菌株的菌落直径(mm)；t＝对照例菌株的菌落直径(mm)。毒力测定的具体实施方式：具有良好的活性的化合物(在200μg/ml的测试浓度下，抑制率>50％)需要进行进一步的评估，使用上述方法将溶液梯度稀释成25、50、100、150和200μg/ml进行毒力测定。ec50值(μg/ml)被定义为达到50％抑制菌丝的生长时所需的待测物的浓度，并将其视为测定指标。11种化学成分对8种植物性病原菌的活性评价结果表1从小叶九里香分离到的11个化学成分对8种测试菌株的抑制率(测试浓度在200μg/ml)table1theinhibitionofelevenchemicalcompositionsfromm.microphyllawiththeconcentrationat200μg/mlagainsteighttestedfungi.注：-表示无抗菌活性，+表示有抗菌活性，其他抗菌活性数据均用三次重复的平均值±标准误表示。1：水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)；2：番茄早疫病菌(alternariasolani)；3：香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)；4：芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)；5：胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)；6：小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)；7：油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)；8：茄孢镰刀菌(fusariumsolani)。抑菌活性的筛选对比:在200μg/ml的测试浓度下，对分离到的11个化合物的活性显示，8个重要的植物病源性真菌对a、b和c系列的咔吧唑生物碱类化合物具有不同的敏感性。就化合物而言，girinimbine和murrayanine具有极好的、广谱的活性(抑制率各自在20％～48％和20％～92％之间)，尤其是化合物murrayanine，完全抑制了8种植物病原菌的生长。因此，我们分别以这两个化合物为参考，对三个系列化合物进行结构活性的比较。在a系列化合物中，girinimbin对6种植物性真菌：水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、番茄早疫病菌(alternariasolani)、香蕉枯萎病菌(fusariumoxysporumf.spcubense)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)、小麦赤霉病菌(fusahumgraminearumsehw.)和油菜菌核病菌(sclerotiniasclerotiorum)均有不错的活性。1位甲氧基取代具有极其重要的地位，它的存在使得koenimbine对这6种植物性真菌活性完全消失，反而对胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)表现出不错的活性(23％)，另一方面也说明，胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)是一个特殊的存在(不同于其他菌株，其作用方式极有可能也不同)；当2位甲氧基取代之后，使得koenidine对6个中的两种病菌水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)和芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)重新有了活性，对胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)的活性却有所下降,可以明确的是2位甲氧基的存在对以上两种菌有积极作用，对胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)有消极作用；但是不能确定的是2位甲氧基的作用还是空间位阻的作用(即不能确定只有2位甲氧基取代是积极作用)。考虑到mahanimbine，16位4’-甲基-3’,4’-戊烯基的取代，严重削弱了对其中这六个中的三个菌株的活性，甚至对另外三个菌株表现出没有意义的活性。但是不能确定的是11位甲基和16位甲基是活性必须的基团。在b系列化合物中，murrayanine最有效的活性，murrayanine的活性与mahanimbine对比girinimbine表现出相似的活性，这里存在两种可能性。10位甲氧基是必要的存在；9位羟基是消极的存在。可以确定的是9位和10位是活性的关键位置，但是不能确定的是11位醛基是活性必须的基团。以上结果表明，植物病原菌的种类对于这些化合物的活性也起到重要的作用，我们可以根据具体的某个作用对象选择合适的化合物。基于我们的结果，它们均可作为先导化合物，尤其murrayanine和girinimbine，并以其母环和侧链结构为基础，针对这几种真菌寻找新的有选择性地或者更为广谱的更为有效果的化合物。而合成的这些化合物也可以去探索更多对其具有敏感的植物病原菌，以及针对这些病原菌与化合物结构之间如何连接的作用机制，运用这些机制再去探索更为有效的化合物，如此往复循环。就目前测试的8个真菌菌种而言，茄孢镰刀菌(fusariumsolani)仅对murrayanine表现出良好的敏感性，而水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)、芒果炭疽病菌(colletotrichummusaegloeosporioidespenz.)和胶胞炭疽病菌(colletotrichumgloeosporioides)均可以被这三个系列的化合物很好的抑制，尤其是针对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)。就本活性筛选的整体而言，我们的直接结果表明murrayanine和girinimbine对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)有更好的抑制效果(抑制率分别为92％和48％)，我们有必要针对murrayanine对水稻稻瘟病菌(magnaporthegrisea(hebert)barr.)的抑菌活性做进一步的毒力测定。murrayanine对水稻稻温病菌进一步的毒力测定结果进一步测定活性化合物murrayanine对水稻稻温病菌菌丝生长的抑制情况，化合物浓度依次为200，150，100，50，25μg/ml，结果见表2。表2从小叶九里香分离到的murrayanine对水稻稻瘟病菌的毒力(测试浓度在50,100,150and200μg/ml)table2toxicityofmurrayaninefromm.microphyllaagainstmagnaporthegrisea(hebert)barr.withdifferentconcentrations(25,50,100,150and200μg/ml)注：表中y为机率值，x为浓度对数。毒力测定结果表明(表2)，murrayanine对水稻稻瘟病菌的毒力呈现一个清晰的剂量-效应关系，ec50值为65.811μg/ml，具有较好的抑制作用，本发明建议murrayanine可以直接作为药剂作用于感染或者易于感染水稻稻瘟病菌病害的作物。以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的范围内。当前第1页12当前第1页12