专利名称：一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法
技术领域：
本发明涉及ー种从植物中提取总黄酮的方法，属于农药技术领域，具体地讲是涉及一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法。
背景技术：
九里香[Murraya paniculata (L.)]属芸香科(Rutaceae)九里香属植物，别名千里香、满山香、七里香等。该属植物全世界约14种及2变种。其中亚洲热带及亚热带地区约有12种，我国有8种及I变种，主要产自中国云南、贵州、湖南、广东、广西、海南、福建、台 湾等地。九里香是我国十大名花之一，也是ー种中药材，现代药理研究表明，九里香具有抗生育和終止妊娠、抗菌消炎、降血糖、抗痉挛及局部麻酔等作用。近年农用活性研究表明，九里香粗提物具有较好的杀虫活性(湖北农业科学，2005 ;农药，2011 ;西北农业学报，2011)。到目前为止，国内外学者已从本属植物中分离到10余种黄酮类化合物。分别为3’，4’，5, 5’，7，8-六甲氧基黄酮，命名为版纳九里香素(bannamurpanisin)。从九里香叶中分离得到5，7，3' ，4'-四甲氧基黄酮、5，7，3'，4'，5'-五甲氧基黄酮和5，6，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮、5，6，7，3'，4'-五甲氧基黄酮、5-羟基-6，7，8，3'，4'-五甲氧基黄酮、5，7，8，3 '，4'-五甲氧基ニ氢黄酮、7-羟基-5，3'，4'-三甲氧基黄酮、3'，5_ ニ羟基-7，4' - ニ甲氧基黄酮。从九里香果实中分得两个新的黄酮类化合物5-羟基-3，7，8，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮，8-羟基-3，5，7，3'，4'，5'-六甲氧基黄酮等。专利《千里香叶总黄酮及其制备方法及用途，申请号200710147357. 2》中，涉及到黄酮的提取方法，该方法使用大孔树脂、Al2O3柱、硅胶柱反复层析得到总黄酮。由于该专利提取总黄酮的过程复杂，不适合于エ业化生产；且需要消耗大量有机溶剂，对环境有一定影响。加之九里香具有重要的药理和农用活性，为此，选择简便快捷的提取方法具有重要意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种从九里香茎叶中简便提取总黄酮的方法，以及总黄酮显著的杀虫活性，有利开发成植物源农药。本发明解决上述技术问题所采用的技术方案如下—种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体エ艺步骤a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；b.将九里香粉末浸泡在50-95%こ醇中5-7天，こ醇用量为九里香粉末重量的10-20倍，随后进行超声波提取30-60分钟；c.减压抽滤，得滤液，加入滤液总量2-4 %的脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩至原来的1/10-1/20，温度控制在50-60°C，回收こ醇；d.向上述浓缩液中加入其重量3-5倍的自来水，在超声波上震荡，温度控制在40-60°C，时间 30-60 分钟；e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入大孔树脂内，大孔树脂用量为九里香粉末重量的1-1. 5倍，使用20倍柱体积的自来水洗脱；再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；f.减压浓缩50-75%こ醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮；g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法測定总黄酮含量在50%以上。所述脱色剂选用硅燥土、白炭黑或活性炭。所述大孔树脂选用DlOl大孔树脂、D140大孔树脂、AB-8大孔树脂或XAD16大孔树 脂。所述自来水的pH值为5-7。本发明具体具有以下优点I、九里香原料来源方便。九里香在南方作为园林绿化植物，每年经过修枝整叶，将去除大量枝叶，为九里香黄酮提取提供大量原材料。2、提取方法简单，适合于エ业化生产。本案例采用こ醇渗漉提取，大孔树脂梯度洗脱分离黄酮化合物，操作流程简便，使用设备简单，洗脱剂常见，可以进行エ业化生产。3、节能环保。所用溶剂包含こ醇，可以回收利用，大孔树脂经活化后可以反复使用。具体实施方法下面结合优选实施例对本发明作进ー步详细说明，但本发明决不限于下述实施例。实施例I一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体エ艺步骤如下a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在30kg 50%こ醇中7天，随后进行超声波提取60分钟；c.减压抽滤，得滤液，加入O. 6 kg的活性炭脱色，过滤，滤液减压浓缩至3kg，温度控制在50°C，回收こ醇；d.向3kg浓缩液中加入9kg自来水，自来水pH值为5，在超声波上震荡，温度控制在60°C，时间30分钟；e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入2kg DlOl大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱，自来水PH值为5 ;再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；f.减压浓缩50-75%こ醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮；g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法測定总黄酮含量为56. 4%。实施例2一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体エ艺步骤如下a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；
b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在25kg 75%こ醇中5天，随后进行超声波提取45分钟；c.减压抽滤，得滤液，加入O. 6 kg的硅藻土脱色，过滤，滤液减压浓缩至2. 5kg，温度控制在55°C，回收こ醇；d.向2. 5kg浓缩液中加入8L自来水，自来水pH值为6，在超声波上震荡，温度控制在55。。，时间40分钟；e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入2kg D140大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱，自来水PH值为6 ;再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴 性。f.减压浓缩50-75%的こ醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法測定总黄酮含量为64. 7%。实施例3一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体エ艺步骤如下a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在20kg 95%的こ醇中6天，随后进行超声波提取50分钟。c.减压抽滤，得滤液；加入O. 6 kg的白炭黑脱色，过滤，滤液减压浓缩至2 kg，温度控制在50°C，回收こ醇。d.向2kg浓缩液中加入6L自来水，在超声波上震荡，温度控制在50°C，时间50分钟。e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入3kg AB-8大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱；再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%的こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性。f.减压浓缩50-75%的こ醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法測定总黄酮含量为67. 3%。实施例4一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其具体エ艺步骤如下a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末；b.取2kg九里香粉末，室温浸泡在40kg 50%的こ醇中7天，随后进行超声波提取30分钟。c.减压抽滤，得滤液，加入I. 6 kg的硅燥土脱色，过滤，滤液减压浓缩至2 kg,温度控制在50°C，回收こ醇。d.向2kg浓缩液中加入IOL自来水，在超声波上震荡，温度控制在40°C，时间60分钟。e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入3kg XAD16大孔树脂内，使用20L的自来水洗脱；再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%的こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性。f.减压浓缩50-75%的こ醇洗脱液，真空干燥得到总黄酮。
g.以芦丁为标准对照样品，用紫外分光光度法測定总黄酮含量为66. 9%。杀虫活性测定实施例本发明所得总黄酮的杀虫活性毒力測定结果如下I、供试昆虫家蚬(Muscadomestica)成虫按照麦麸250. 0g、面粉12. 5g、奶粉8. 0g、酵母粉2. 5g,水500mL饲料配方进行家蝇幼虫饲养，经过化蛹,羽化转化成成虫供试。萝卜虫牙[Lipaphiserysimi (Kaltenbach)]:直接从田间采集。斜纹夜蛾(Predenia Iiture):从田间采集斜纹夜蛾卵块,于室内以新鲜蓖麻叶饲养繁殖，试验时挑选健康、整体大小一致的3龄、5龄幼虫。2、对家蝇的触杀活性(点滴法)用无水こ醚将家蝇麻醉I分钟，使试虫处于麻醉状态，然后用微量注射器取5 μ L的药液点滴到家蝇的前胸背板，放入养虫盒内，同时放入成虫饲料和保湿的脱脂棉。标准对照药剂为O. 7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白対照。每处理20头试虫，重复3次。24h后观察死亡情況，计算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡虫数/试虫数)X 100 ;校正死亡率(%)=[(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/ (100-对照组死亡率)]X 100。3、对萝卜蚜的触杀活性(喷雾法)将辣椒叶片剪至6cm塑料培养皿大小，背面朝上，置于培养皿内，皿底垫ー层保湿滤纸。用毛笔选取无翅若蚜25头，放入培养皿叶蝶上。置于POTTER喷雾塔下喷雾(ImL)。标准对照药剂为O. 7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白对照。喷雾后加盖，标记后置于室温下，每个处理重复3次。48h后检查结果，计算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡虫数/试虫数)X 100 ;校正死亡率(%)=[(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/ (100-对照组死亡率)]X 100。4、对斜纹夜蛾的毒杀活性将3龄或5龄斜纹夜蛾幼虫，在药液中浸溃5s，取出后用吸水纸去除多余药液，然后放入直径为9cm的培养皿中，每皿放入10头试虫，饲喂新鲜的甘蓝叶片，皿内放入ー团保湿脱脂棉。标准对照药剂为O. 7%印楝素悬浮剂(河南鹤壁陶英陶生物科技有限公司)，清水为空白対照。每处理30头试虫，重复3次。视取食情况及时添加新鲜甘蓝叶片。48h后调查死亡数，计算死亡率或校正死亡率。死亡率(%)=(死亡虫数/试虫数)X 100 ;校正死亡率(%)=[(药剂处理死亡率-对照组死亡率)/ (100-对照组死亡率)]X 100。表I黄酮类化合物对供试害虫的杀虫活性
权利要求
1.一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体エ艺步骤 a.采摘九里香枝叶，自然晾干，粉碎，过40目筛，得九里香粉末； b.将九里香粉末浸泡在50-95%こ醇中5-7天，こ醇用量为九里香粉末重量的10-20倍，随后进行超声波提取30-60分钟； c.减压抽滤，得滤液，加入滤液总量2-4%的脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩至原来的1/10-1/20，温度控制在50-60°C，回收こ醇； d.向上述浓缩液中加入其重量3-5倍的自来水，在超声波上震荡，温度控制在40-60°C，时间 30-60 分钟； e.过滤，除去不溶物，滤液缓慢加入大孔树脂内，大孔树脂用量为九里香粉末重量的1-1. 5倍，使用20倍柱体积的自来水洗脱；再用10-20%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阳性；改用50-75%こ醇洗脱，使用AlCl3为显色剂，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性； f.减压浓缩50-75%こ醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮； g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法測定总黄酮含量在50%以上。
2.根据权利要求I所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于所述脱色剂选用硅燥土、白炭黑或活性炭。
3.根据权利要求I所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于所述大孔树脂选用DlOl大孔树脂、D140大孔树脂、AB-8大孔树脂或XAD16大孔树脂。
4.根据权利要求I所述的从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于所述自来水的pH值为5-7。
全文摘要
本发明公开了一种从九里香茎叶中提取总黄酮的方法，其特征在于采用如下具体工艺步骤a.制备九里香粉末；b.浸泡九里香粉末，进行超声波提取；c.减压抽滤，脱色剂脱色，过滤，滤液减压浓缩；d.向上述浓缩液中加入自来水，在超声波上震荡；e.过滤，除去不溶物，滤液加入大孔树脂内，自来水洗脱；再用不同浓度的乙醇反复洗脱，用AlCl3显色，检测洗脱液，直到流出物呈现阴性；f.减压浓缩乙醇的洗脱液，真空干燥得到总黄酮；g.以芦丁为标准对照，用紫外分光光度法测定总黄酮含量在50％以上。本发明具有九里香原料来源方便，提取方法简单，适合于工业化生产，节能环保的优点。
文档编号A01N65/36GK102669195SQ201210187890
公开日2012年9月19日 申请日期2012年6月7日 优先权日2012年6月7日
发明者曹阳, 王兰英, 骆焱平 申请人:海南大学