本发明涉及一种川贝母种子的超低温保存方法，属于种质资源保存的技术领域。
背景技术：
川贝母又称川贝母母、暗紫贝母、甘肃贝母、梭砂贝母的干燥鳞茎。多年生草本，高15～25cm。鳞茎球形或圆锥形。茎直立,无毛，绿色或暗紫色。叶除最下部为对生外,均为互生或近于对生，无柄；叶片线形或线状披针形,长3.6～6.5cm,宽3～7mm,先端急尖。花单生于茎顶；深紫色，略有黄褐色小方格,有叶状苞片1,花被片6,长2.5～2.7cm,外轮3片近长圆形，宽6～9mm,内轮3片倒卵状长圆形，宽10～13mm,蜜腺窝不很明显；雄蕊6,花药近基着，花丝有时密被小乳突；柱头3裂,裂片外展，长0.5～1(～1.5)mm。蒴果长圆形,具6棱，棱上有宽约1mm的窄翅。花期6月,果期8月。生于海拔3200～4500m的草地上。质硬脆，断面白色，富粉性。气微，味微苦。
种质资源研究的首要任务是收集种质，安全保存种质。目前种质资源保存方式为常温、低温保存川贝母种子两种方式。常温保存中药材种子，每保存5年就需要重新繁种更新，因为植物种子经过5年的保存，活力降低很快，只有50％左右；低温保存中药材种子，在中国，建立了国家中期库和国家种质库，国家中期库保存的温度为4℃左右，相对湿度小于65％，一般设计贮藏种子的寿命为5～10年，国家种质库为种质长期保存库，库中的温度为‐18℃左右，相对湿度小于50％，设计贮藏寿命达20年以上，也就是说种质在长期库中保存，活力同样随着时间的推移降低，种质20年后一般需要更新繁种，不是永久的保存。
因此，为了安全保存川贝母种质资源，研究探索一种安全而长久保存川贝母种质资源的方法很有意义，它能够减少或者避免种子更新繁种，省时省力，阻断繁种更新的过程中种质间基因漂移等产生种质变异，保证种质的遗传稳定性。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种适合于川贝母种子的超低温保存法，该方法能够补充现在川贝母种质资源保存技术的不足，可以长期安全的保存川贝母种质资源，为川贝母种质资源保存提供一条新的有效的技术途径。
本发明的目的是提供一种川贝母种子超低温保存方法，包括步骤以下：
(1)室温下将川贝母种子用a试剂处理，处理20～50min后，取出处理过的川贝母种子；
(2)处理过的川贝母种子放入装有b试剂的冻存管中，室温温育15～35min，再将其放入梯度降温盒中；
(3)将带有川贝母种子的梯度降温盒放入低温冰箱中，使其降温盒的温度在‐35℃～‐60℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存备用。
在一个具体方案中，步骤(1)中所述a试剂是指b5液体培养液，还包含有1.5～2.5mol/l甘油和1～1.5mol/l二甲基亚砜。
所述a试剂优选110～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述梯度降温盒中含有100％甘油或异丙醇，可以重复使用。
在一个具体方案中，步骤(2)中所述b试剂是指b5液体培养液，还包含有2.6～3.6mol/l甘油、1.6～2mol/l二甲基亚砜和0.45～0.75mol/l蔗糖。
所述b试剂优选110～121℃高压蒸汽灭菌15min以上，冷却至室温放置。
在一个具体方案中，步骤(3)中所述低温冰箱的温度要求一般在‐70℃以下。
川贝母上述所保存的川贝母种子进行解冻时，若室温超过20℃，将冻存管从液氮中取出，直接利用室温自然解冻；若室温低于20℃，将冻存管从液氮中取出，并置于20～24℃水浴箱中解冻。解冻完后，取出冻存管中川贝母种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤3～5次，清洗后川贝母种子直接用于培养。
技术效果
1、本发明进行川贝母超低温保存，工艺简单，稳定性可靠，保存后的川贝母种子的发芽率和鲜种的发芽率无显著性差异，发芽试验结果表明超低温保存后川贝母种子发芽率高达90％以上。
2、本发明具有长期、有效、安全保存川贝母种子，是川贝母种质资源长期保存的最有效方法。
具体实施方式
下面，本发明将用实施例进行进一步的说明，但是它并不限于这些实施例的任何一个或类似实例。
实施例1
取某地当年收获的川贝母，自然晒干，将含水量10.5％左右的川贝母种子用含有2.35mol/l甘油和1.25mol/l二甲基亚砜的b5液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的川贝母种子，再放入含有3.2mol/l甘油、1.65mol/l二甲基亚砜和0.65mol/l蔗糖的b5液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入梯度降温盒中；川贝母将梯度降温盒放进‐70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在‐50℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存6年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中川贝母种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后川贝母种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到97.48％。
对照实施例1
取某地当年收获的川贝母，自然晒干，将含水量10.5％左右的川贝母种子用含有2.35mol/l甘油的b5液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的川贝母种子，再放入含有3.2mol/l甘油、1.65mol/l二甲基亚砜和0.65mol/l蔗糖的b5液体培养液的冻存管中，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进‐70℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在‐50℃，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存6年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中川贝母种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后川贝母种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到84.62％。
对照实施例2
取某地当年收获的川贝母，自然晒干，将含水量10.5％左右的川贝母种子用含有2.35mol/l甘油和1.25mol/l二甲基亚砜的b5液体培养液处理，处理20min后，取出处理过的川贝母种子，再放入含有3.2mol/l甘油、1.65mol/l二甲基亚砜和0.65mol/l蔗糖的b5液体培养液的冻存管中，室温温育30min，再将其放入在‐5℃左右低温冰箱保存6年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中川贝母种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后川贝母种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到38.61％。而取新鲜川贝母1～5℃下低温保存6年后，用于发芽实验，经测试川贝母未能发芽。
实施例2
取某地当年收获的川贝母，自然晒干，将含水量6％左右的川贝母种子用含有2.4mol/l甘油和1.45mol/l二甲基亚砜的b5液体培养液处理，处理30min后，取出处理过的川贝母种子，再放入含有3.3mol/l甘油、1.75mol/l二甲基亚砜和0.55mol/l蔗糖的b5液体培养液的冻存管中，室温温育20min，再将其放入梯度降温盒中；将梯度降温盒放进‐80℃低温冰箱进行梯度降温，使其降温盒的温度在‐55℃左右，降温速度为‐1℃/min，然后取出降温盒，马上将此降温盒放入液氮中，进行液氮低温保存8年后，将冻存管从液氮中取出，放置室温在23℃左右，直接利用室温自然解冻，解冻完后，取出冻存管中川贝母种子，再用自来水或者蒸馏水洗涤4次，清洗后川贝母种子直接用于发芽实验，经测试发芽率达到97.24％。