一种温郁金组织培养再生植株的方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种温郁金组织培养再生植株的方法。

(二)

背景技术：

温郁金(curcumawenyujiny.h.chenetc.ling)，别名温莪术、黑郁金，主要产于浙江温州瑞安一带，为姜科植物，其块根是著名的“浙八味”药材之一。温郁金作为浙江的道地药材，其性味辛、苦、温，归肝、脾经，具行气破血、消积止痛功效。现代药理研究表明，温郁金具有抗肿瘤、抗血栓、抗菌、抗病毒作用，对呼吸系统、消化系统、泌尿生殖系统、循环系统和皮肤溃疡都有较好的疗效。由于其药用功能非常广泛，在中医临床治疗中广泛应用。

温郁金主要以根茎繁殖，易感染病毒，且受到多种病虫害的危害。由于其长期的无性繁殖，导致种群退化，病毒化严重，严重影响产量和品质，难以得到安全、有效、稳定、可控的温郁金药材。为了提纯复壮温郁金资源，快速繁殖获得良种，因此，通过植物组织培养技术建立温郁金的快速高效的繁殖体系非常必要。目前虽然有个别报道，利用组织培养获得了温郁金的再生植株，但均存在培养过程中外植体污染严重，且再生植株频率低等问题。

(三)

技术实现要素：

本发明目的是提供一种无污染的、高效的快速繁殖温郁金的方法，克服了目前温郁金组织培养污染严重、再生频率低、再生过程时间长等问题，在生产实践中有利于温郁金的品种改良。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种温郁金组织培养再生植株的方法，所述方法为：(1)外植体的获取及诱导培养：选取长势良好、无病虫害的温郁金外植体消毒，获得消毒后的外植体；将消毒后的外植体接种至丛生芽培养基中，在20～25℃，光照1000～1200lux条件下培养，获得丛生芽；所述丛生芽培养基为含6-ba(6-苄基腺嘌呤)0.25～2.5mg/l+iaa(吲哚乙酸)0.25～2.5mg/l+zt(玉米素)0.25～2.5mg/l+cef(头孢霉素)100-1000mg/l的ms基本培养基；(2)生根培养：将步骤(1)获得的丛生芽切割为带顶芽的个体后，接种至生根培养基，在20～25℃，光照1000～1200lux条件下培养15-20天，形成带根的完整植株；所述生根培养基为含6-ba0.25～2.5mg/l+0.25～2.5mg/liaa的ms基本培养基。

进一步，步骤(1)所述外植体为下列之一：温郁金块根、温郁金块根发芽的芽尖段、温郁金实生苗的茎段或顶端的幼叶。

进一步，步骤(1)所述外植体为温郁金实生苗的芽尖段。

进一步，所述芽尖段按如下方法获取：取健壮的块根，埋入用体积比4：1的泥炭和蛭石混合而成的培养土中，保持培养土湿润，20-25℃条件下30-40天，待块根长出1-1.5cm长的芽尖，从离块根0.1-0.2cm处剪取芽尖，即为温郁金实生苗的芽尖段。

进一步，步骤(1)所述消毒方法为：先将外植体用含体积浓度0.1％洗洁精的自来水清洗液浸泡10分钟，再用自来水漂洗3次，最后在消毒液中浸泡5-50min，消毒后的外植体用无菌的双蒸馏水冲洗3次；所述消毒液为质量浓度0.1％升汞水溶液、质量浓度3％双氧水或质量浓度6％次氯酸钠水溶液(即稀释5倍的安替福民)。

进一步，步骤(1)所述丛生芽培养基为含6-ba(6-苄基腺嘌呤)1～2.5mg/l+iaa(吲哚乙酸)0.5～1.5mg/l+zt(玉米素)0.5～1.5mg/l+cef(头孢霉素)400-600mg/l的ms基本培养基；更优选所述丛生芽培养基为含6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l+cef500mg/l的ms基本培养基。

进一步，步骤(2)所述生根培养基为含6-ba0.3～1.0mg/l+0.3～1.0mg/liaa的ms基本培养基，更优选所述生根培养基为含0.5mg/liaa+0.5mg/l6-ba的ms基本培养基。

进一步，所述ms基本培养基终浓度组成为：nh4no31.65g/l、kno31.9g/l、cacl2·2h2o0.44g/l、mgso4·7h2o0.37g/l、kh2po40.17g/l、ki0.83mg/l、h3bo35.2mg/l、mgso4·7h2o22.3mg/l、znso4·7h2o3.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、na2edta37.3mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂粉10g/l，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)外植体培养过程中无任何污染、克服了以前报道的温郁金培养容易污染的严重问题。(2)形成丛生芽和再生完整植株的过程快速高效。外植体培养25-30天即可得到大量的芽生丛，丛生芽切割后在生根培养基上15-20天，即可到达含粗壮根系的完整植株。

(四)附图说明

图1外植体芽尖段接种于ms+6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l+cef500mg/l培养基中分化出的小芽。

图2外植体芽尖段在ms+6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l+cef500mg/l培养基中培养25天后形成的丛生芽。

图3移栽在含培养土的盆钵中成活的再生植株(移栽后10天)。

图4移栽在含培养土的盆钵中成活的再生植株(移栽后30天)。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

本发明所述ms基本培养基终浓度组成为：nh4no31.65g/l、kno31.9g/l、cacl2·2h2o0.44g/l、mgso4·7h2o0.37g/l、kh2po40.17g/l、ki0.83mg/l、h3bo35.2mg/l、mgso4·7h2o22.3mg/l、znso4·7h2o3.6mg/l、na2moo4·2h2o0.25mg/l、cuso4·5h2o0.025mg/l、cocl2·6h2o0.025mg/l、na2edta37.3mg/l、feso4·7h2o27.8mg/l、肌醇100mg/l、甘氨酸2mg/l、盐酸硫胺素0.1mg/l、盐酸吡哆醇0.5mg/l、烟酸0.5mg/l、蔗糖30g/l、琼脂粉10g/l，溶剂为水，ph为5.6～6.0。

实施例1：

1、外植体的选择：

利用健壮的温郁金块根，埋入用泥炭：蛭石＝4:1(v/v)配比配制的培养土中，保持培养土湿润，20-25℃条件下30-40天，待块根长出1-1.5cm长的芽尖，从离块根0.1-0.2cm处剪取芽尖作为芽尖段为外植体。

再取温郁金块根及田间生长的温郁金实生苗的茎段、顶端的幼叶为外植体。

2、外植体的消毒

每种外植体取下来后，先用含少量洗洁精的自来水清洗液(洗洁精/自来水(v/v)＝1/1000)浸泡10分钟，再用自来水漂洗3次，最后转入不同的消毒液中消毒(表1，稀释5倍安替福民即为质量浓度6％次氯酸钠水溶液)。消毒后的外植体用无菌的双蒸馏水冲洗3次，转入ms+6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l的培养基中，每种消毒方法外植体接种20个，20-25℃，光照1000～1200lux，12小时光照/天，观察外植体污染情况，结果见表1。

表1不同消毒方法外植体污染情况

3、外植体的消毒方法对丛生芽的影响

将步骤2中各个方法消毒后无污染的外植体接种在ms+6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l的培养基中，20-25℃，光照1000～1200lux，12小时光照/天。20天后，统计培养情况见表2。

表2不同消毒方法以及不同外植体再分化情况

根据表1和表2的结果可知，只有0.1％升汞10min和15min消毒的芽尖段才能分化出丛生芽。其中，0.1％升汞10min灭菌，分化丛生芽频率最高。为此，选择在0.1％升汞10min的灭菌方法，利用芽尖段作为外植体，做进一步优化实验。

4、芽尖段不同部位以及在添加头孢霉素培养基上的污染和再分化情况

利用健壮的块根，埋入用泥炭：蛭石＝4:1(v/v)配比配制的培养土中，保持培养土湿润，20-25℃条件下30-40天，待块根长出1-1.5cm长的芽尖，从离块根0.1-0.2cm处剪取芽尖。先用含少量洗洁精的自来水清洗液(洗洁精：自来水＝1：1000(v/v))浸泡10分钟，再用自来水漂洗3次。芽尖的顶端向下放入2ml的平底冻存管中，用加样器加入1.8ml0.1％的升汞，盖严瓶盖，期间每间隔2分钟，颠倒冻存管数次。10min后，用加样器吸除消毒液0.1％的升汞。随后每次加入1.8mlddh2o漂洗5次，再用剪子将芽尖剪成长均等的2段。接种于ms+6-ba2mg/l+zt1mg/l+iaa1mg/l+cef(头孢霉素)500mg/l的丛生芽培养基中，在20-25℃，光照1000～1200lux，12小时光照/天下培养。结果显示，在接种的100个外植体中，全部无污染；而且茎尖段靠基部的区段，3-5天即可见芽段有萌动(图1)，在15-20天即可见分化出小芽丛，且所有接种的外植体均能全部再分化出芽丛；但茎尖的顶端只生长，不能分化出芽生丛。外植体培养25-30天后，每个外植体均可分化出大量的丛生芽(图2)。将再生的丛生芽切割后，转入ms+6-ba0.5mg/l+iaa0.5mg/l的生根培养基中，在20-25℃，光照1000～1200lux，12小时光照/天下培养。丛生芽在生长过程中无任何污染出现，且生长旺盛。再经过15-20天，即可到达含粗壮根系的完整植株。洗除植株根的基部培养基，移栽用泥炭：蛭石＝4:1(v/v)配比配制的培养土中，18-28℃、散射光下10天后(图3)，转入室外在自然条件下生长，即获得健壮的实生苗(图4)。

利用本发明的方法，能够实现温郁金外植体培养过程中无任何污染出现，在50天内即可获得完整的再生植株，在60天内即可获得成活的实生苗。