金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养方法与流程

本发明涉及金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养方法，属于植物的组培
技术领域：
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背景技术：
：金线莲(aonceothcilsroxburghii)，别名金线兰、金蚕等，为兰科(orchidaceae)开唇兰属(anoectochilusbl.)，多年生草本植物(张铁，2013、周雨青等，2017)。金线莲为名贵中草药，享有“药王”、“金草”等美誉，全草入药，具有清凉解毒、滋阴降火、消炎止痛之功效，对许多疑难杂症治疗有良好效果(周雨青等2017)。因其株型小巧，叶型优美，叶脉金黄色，呈网状排列，也是室内观叶珍品。金线莲的市场需求量近几年不断增大，而其多生长于山林地下的阴湿处，喜荫避阳，自然条件下结实率低、繁殖力差、生长缓慢(何碧珠等，2013)。自然环境恶化加上人为破坏，金线莲的野生资源日渐枯竭(张晋彦等，2016)。目前生产上所用的金线莲种苗均来源于组培繁育苗，金线莲的组织培养一般有以下3条途径：(1)先进行愈伤组织诱导，之后诱导根芽分化；(2)诱导金线莲外植体萌发腋芽和顶芽，对这些芽进行2次继代培养；(3)利用种子诱导其在无菌条件下萌发，产生原球茎(何碧珠等，2013；张晋彦等，2016)，这3条途径均需要经过多个生长阶段，不同生长阶段对营养成分及激素的需要不同，因此需多次转瓶。整个生长周期长，污染率高，成活率低，增加了企业生产成本和种植难度，影响了产业发展。现有技术中，金线莲一步成苗的组培技术研究均选用茎段或带芽茎段作为外植体，培养基配方复杂、成本高，培养周期较长需4个月(江德胜专利，江建铭专利)。技术实现要素：针对上述现有技术，本发明提供了一种金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养方法。本发明选用带一片叶金线莲中部茎段为外植体进行一步成苗组织培养，培养过程无需转瓶，降低了污染率，提高了成活率。由于叶片能够进行光合作用，已经具备完整植株的生理功能，因此对培养基养分的要求低、成本低，组培成活率98％以上，90天即可出瓶，比直接使用茎段作为外植体的一步成苗组织培养方式的培养周期缩短了30天，大大降低了金线莲组织培养繁育的成本。本发明是通过以下技术方案实现的：金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养方法：采用带一片叶的金线莲中部茎段作为外植体进行培养，所用培养基为改良ms培养基，并添加终浓度为0.2～1.0mg/l(优选0.4mg/l)的激素吲哚丁酸(iba)；培养条件为：24～26℃，光照12～14小时/天，光照强度2000～4000lux；培养90天以上，即得适合炼苗出瓶的完整植株；炼苗3天，将金线莲苗从培养基中取出，清水洗净根部残余培养基，移栽至已用多菌灵处理过的配比为泥炭土：珍珠岩：木屑＝2:1:1的基质中，培植3个月后育成壮苗。所述改良ms培养基，是通过以下方法得到的：在ms培养基的基础上，将蔗糖终浓度调整为25g/l，添加终浓度为0.05％的活性炭(ac)，调节ph至5.5～6.0(优选5.8)，添加终浓度为7g/l的琼脂。优选的，所述培养条件为：24～26℃，光照12小时/天，光照强度2000lux，培养90天。本发明的金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养方法，直接采用带一片叶金线莲中部茎段作为外植体，对培养基的养分要求低，培养期间不需转瓶继代培养，培养90天可长成株高约4cm，展叶3至4片，发根2至3条，根长约2.1cm，茎粗约2.8mm，根粗约1.7mm，叶片长度约1.8cm，叶片宽度约1.7cm且叶表面呈鹅绒壮、叶脉清晰可见，叶背浅红的健康幼苗,即可出瓶，组培成活率98％以上，移栽成功率95％以上，具有成本低、污染率低、成活率高、周期短等优点。附图说明图1：培养基激素种类及浓度筛选实验结果示意图。图2：培养条件筛选实验结果示意图。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。实验1金线莲带叶茎段一步成苗的组织培养条件的筛选(一)培养基激素及浓度范围的确定采用带一片叶的金线莲植株中段茎段作为外植体，插入不同组别培养基中(表1)，培养基为ms改良培养基(ms培养基中，调整蔗糖终浓度25g/l，添加终浓度为7g/l的琼脂、0.05％的活性炭，调节ph至5.8)，选择α-萘乙酸(naa)，吲哚丁酸(iba)两种激素，设置浓度梯度0.2mg/l～1.0mg/l，每瓶培养基插入2株，每组10个重复，培养基ph5.8，培养温度25℃，光照12小时/天，光照强度2000lux，培养90天。结果如图1、表2所示，所得实验结果经过差异显著性分析(dps)，综合各项生理指标，组别7生长最好(图1)(与其它各组相比，均有显著差异)，平均株高3.75cm，平均茎粗2.77mm，平均展叶3.6片，平均叶片长度1.75cm，平均叶片宽度1.66cm，平均发根2.65条，平均根长1.95mm，平均根粗1.65mm(表2)。因此，选择该组培养基及激素浓度作为最佳，本组实验共插苗220株，经统计，白化苗1株，褐化苗3株，其余216株叶片墨绿，生长健康，无畸形，成活率98.18％。表1金线莲一步成苗培养基激素及浓度的筛选组别0(ck)ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)1ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+naa(0.2mg/l)2ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+naa(0.4mg/l)3ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+naa(0.6mg/l)4ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+naa(0.8mg/l)5ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+naa(1.0mg/l)6ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+iba(0.2mg/l)7ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+iba(0.4mg/l)8ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+iba(0.6mg/l)9ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+iba(0.8mg/l)10ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)+iba(1.0mg/l)注：ac代表活性炭，naa代表α-萘乙酸，iba代表吲哚丁酸。表2金线莲一步成苗激素种类及浓度筛选实验结果组别株高(cm)茎粗(mm)展叶(片)叶片长(cm)叶片宽(cm)根数(条)根长(cm)根粗(mm)0组2.5fe2.24dc2.65cdcd1.32ee1.02dc1.35bc1.23ff1.03ff1组3.02ded2.58abcab2.9bcdbcd1.6abcabcd1.35bcb2ababc1.375efef1.27cdecde2组3.15cdebcd2.41cdbc2.4dd1.56abcdabcde1.33bcb1.4bbc1.62cdcd1.24dedef3组3.25bcdebcd2.64abcab2.9bcdbcd1.67abab1.25cb2ababc1.54dede1.46abcabc4组2.95ded2.67abab3.3abab1.64abab1.42bb2ababc1.58dd1.21defdef5组3.47abcabc2.53abcabc3.2ababc1.48bcdebcde1.33bcb2.2aab1.78bcbc1.57aab6组3.56abab2.75aa3.1abcabc1.73aab1.34bcb2.3aa1.65cdcd1.56abab7组3.75aa2.77aa3.6aa1.75aa1.66aa2.65aa1.95aab1.65aa8组3.31bcdbcd2.62abcab3.1abcabc1.63ababc1.65aa2.5aa2aa1.37bcdbcd9组3.05decd2.49bcdabc3.1abcabc1.35dede1.63aa2.2aab1.85abab1.12efef10组2.94ed2.69abab2.9bcdbcd1.38cdecde1.35bcb1.95ababc1.64cdcd1.33cdcde注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)，不同大写字母表示差异极显著(α＝0.01)(二)培养条件的确定在上述培养基激素筛选的基础上，使用培养基：ms+蔗糖(25g/l)+琼脂(7g/l)+ac(0.05％)，添加激素iba在浓度0.4mg/l，设置不同培养条件，培养90天后，对比金线莲的生长情况，每瓶2株，每组10个重复(见表3)。结果如图2、表4所示。对比实验结果并进行差异显著性分析(dps)发现，d组实验条件最有利于金线莲的生长(图2)。平均株高3.98cm，平均茎粗2.83mm，平均展叶3.55片，平均叶片长度1.85cm，平均叶片宽度1.65cm，平均发根2.7条，平均根长2.08cm,平均根粗1.65mm(表4)。因此，最佳的培养条件为：24～26℃，光照12小时/天，光照强度2000lux；本组实验共插苗80株，经统计褐化苗1株，其余79株叶片墨绿，生长健康，无畸形，成活率98.75％。表3金线莲一步成苗组织培养条件组别温度(℃)日光照时间(小时)光照强度(lux)a24-26122000b24-26144000c24-26124000d24-26142000表4金线莲一步成苗组织培养条件筛选实验结果组别株高(cm)茎粗(mm)展叶(片)叶片长(cm)叶片宽(cm)根数(条)根长(cm)根粗(mm)a3.81aa2.65abab3.2abab1.82aa1.45bb2.3abab2.03aa1.6aab3.44bb2.56bcab3bab1.65bab1.32bcbc2.1abab1.75bb1.3bbc3.29bb2.4cb2.9bb1.59bb1.23cc1.9bb1.73bb1.2bbd3.98aa2.83aa3.55aa1.85aa1.65aa2.7aa2.08aa1.65aa注：同列数据后不同小写字母表示差异显著(α＝0.05)，不同大写字母表示差异极显著(α＝0.01)(三)移栽成活率实验栽培基质配比为泥炭土：珍珠岩：木屑＝2:1:1，用50％多菌灵可湿性粉剂处理，每平方米施用量1.5g。金线莲带一片叶的茎段在上述实验筛选出的最佳的金线莲培养基及培养条件(ms+25g/l蔗糖+7g/l琼脂+0.05％ac+0.4mg/liba，24～26℃，光照12小时/天，光照强度2000lux)下，经过90天的培养，开盖炼苗3天，将金线莲苗从培养基中取出，清水洗净根部残余培养基，移栽至处理好的基质中，培养3个月，测定该组培苗的移栽成活率。实验分5个重复，每个重复100株。结果表明(表5),通过以上组织培养方法培育的金线莲瓶苗，平均移栽成活率可达到95.8％。表5金线莲一步成苗组培方法移栽成活率实验结果当前第1页12