一种基于愈伤组织分化的柽柳组培分化体系的制作方法

本发明涉及一种基于愈伤组织分化的柽柳组培分化体系。

背景技术：

本发明公开了一种刚毛柽柳(tamarixhispida)愈伤组织诱导、分化及植株再生的方法。该方法将外植体置于诱导培养基中诱导培养形成愈伤组织，后将愈伤组织置于分化培养基中培养并继代形成芽、将芽在分化培养基中培养长成有1-2cm高的不定芽后利用继代培养移植到生根培养基中生根培养，从而获得根系发达的刚毛柽柳无性繁殖组培苗。刚毛柽柳是柽柳科柽柳属植物，灌木或小乔木。柽柳根系发达且具有强的抗旱、耐盐、耐水湿、抗沙埋能力，是优良的防风固沙、水土保持和盐碱地造林树种之一。但由于国内没有公开报道的刚毛柽柳愈伤组织诱导分化技术,且在此发明之前一般采用外植体作为诱导出的愈伤组织质量较差,造成分化不成功，故至今刚毛柽柳愈伤组织分化及植株再生的组织培养技术体系一直未真正建立，这影响了以此技术为基础的刚毛柽柳推广栽培和转基因技术体系的发展因此，当前急需探讨一种刚毛柽柳愈伤组织诱导、高效分化及植株再生技术方法,为刚毛柽柳的无性快速繁殖和刚毛柽柳转基因技术的建立提供技术支撑。本发明建立了一套刚毛柽柳愈伤组织诱导、分化和植株再生的方法、利用该方法可以高效地获得愈伤组织并成功完成愈伤组织分化和植株再生过程,解决了刚毛柽柳愈伤组织分化及植株再生难题、为刚毛柽柳快速繁殖和转基因技术奠定了技术基础、促进刚毛柽柳组织培养技术的发展。而且将本发明应用于生产实践可为荒漠化综合防治及盐碱地土质改良提供充足的，优质的种苗来源。

技术实现要素：

本发明是要解决现有刚毛柽柳组织愈伤分化及再生难的问题，为刚毛柽柳快速繁殖和转基因技术奠定了技术基础，提供一种繁殖系数高、速度快、有利于推广栽培优良品种的基于愈伤组织分化的刚毛柽柳再生体系。

本发明刚毛柽柳愈伤组织分化体系，按以下步骤进行：

一、获取刚毛柽柳无菌外植体；

二、将步骤一取得的外植体置于诱导培养基中，在黑暗、温度为25℃的培养箱中诱导形成愈伤组织；

三、将步骤二得到的愈伤组织置于分化培养基中，在光照与黑暗条件下交替培养，形成芽；其中，光照培养的温度为25℃，周期为14h，光照强度为500mmolm-2s^-1；黑暗培养的温度为23℃，周期为10h；

四、将步骤三得到的芽置于分化培养基中继续培养后，待刚毛柽柳生长至1～2cm，无菌操作下剪取根上部分，移至生根培养基中，培养直至生根形成幼苗。

其中步骤二中所述的诱导培养基为含2.0mg/lnaa的ms固体培养基(ph＝5.8)。

步骤三中所述的分化培养基为含1.0mg/l6-ba的ms固体培养基(ph＝5.8)。

步骤四中所述的生根培养基为含0.2mg/lnaa的ms固体培养基(ph＝5.8)。

本发明的有益效果：

一、建立了基于愈伤组织分化的无性快繁体系，克服了以顶芽或腋芽进行微繁快繁和扦插等繁殖技术外植体数量有限的问题；

二、本发明以刚毛柽柳外植体获得愈伤组织并成功分化最终形成完整植株，解决了刚毛柽柳组织培养技术中的愈伤组织分化及再生这一关键问题和难题，是刚毛柽柳组织培养研究中的一个重要创新。

三、采用该方法可以获得高质量愈伤组织及组培苗,为刚毛柽柳快速繁殖和转基因技术奠定了技术基础,促进刚毛柽柳组织培养技术的发展，同时为刚毛柽柳推广栽培提供了技术支撑。

附图说明：

图1为通过继代培养柽柳组培苗获得的无菌外植体；

图2为诱导培养后的柽柳愈伤早期；

图3为诱导培养后的柽柳愈伤后期；

图4为诱导培养后的柽柳愈伤长出的早期芽点；

图5为诱导培养后的柽柳愈伤长出的后期芽点；

图6为柽柳芽点在诱导培养基10天后的小芽；

图7为柽柳芽点在诱导培养基30天后的小芽；

图8为柽柳小芽转至生根培养基45天后得到根系发达的全瓶刚毛柽柳；

图9为柽柳小芽转至生根培养基45天后得到根系发达的单株刚毛柽柳。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的一种基于愈伤组织分化的柽柳组培分化体系是按照以下步骤进行的：

一、获取刚毛柽柳无菌外植体；

二、将步骤一取得的外植体置于诱导培养基中，在黑暗、温度为25℃的培养箱中诱导形成愈伤组织；

三、将步骤二得到的愈伤组织置于分化培养基中，在光照与黑暗条件下交替培养，形成芽；其中，光照培养的温度为25℃，周期为14h，光照强度为500mmolm^-2s^-1；黑暗培养的温度为23℃，周期为10h；

四、将步骤三得到的芽置于分化培养基中继续培养后，待刚毛柽柳生长至1～2cm，无菌操作下剪取根上部分，移至生根培养基中，培养直至生根形成幼苗。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中诱导培养基为含浓度为2.0mg/lnaa的ms固体培养基，ph＝5.8。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中的分化培养基为含浓度为1.0mg/l6-ba的ms固体培养基，ph＝5.8。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中的生根培养基为含浓度为0.2mg/lnaa的ms固体培养基，ph＝5.8。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：刚毛柽柳无菌外植体选取自继代培养30-35天的株高为3.0-5.0cm刚毛柽柳组培苗，或者选取自然界生长1～3的刚毛柽柳实生苗。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：刚毛柽柳无菌外植体是选取刚毛柽柳幼嫩的部位，在超净工作台用70％酒精处理30s后用0.1％的氯化汞消毒6-10min，然后用无菌水冲洗3-5遍。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三的光照培养的温度为25℃，周期为14h，光照强度为500mmolm^-2s^-1；黑暗培养的温度为23℃，周期为10h。其它与具体实施方式一相同。

本发明内容不仅限于上述各实施方式的内容，其中一个或几个具体实施方式的组合同样也可以实现发明的目的。

通过以下实施例验证本发明的有益效果：

实施例1

本实施例的一种基于愈伤组织分化的刚毛柽柳分化体系，是按以下步骤进行：

一、外植体选取来自继代培养30-35天的株高为3.0-5.0cm刚毛柽柳组培苗，或者选取在自然界生长2月左右的刚毛柽柳实生苗，选取幼嫩的部位，在超净工作台用70％酒精处理30s,后用0.1％的氯化汞消毒6-10min(视苗的具体情况而定，如果发现有萎蔫现象，消毒时间适当减少)，然后用无菌水冲洗3-5遍。获得柽柳的无菌外植体。

二、将获得的无菌外植体放在愈伤组织诱导培养基培养基(ms培养基+2.0mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂粉ph＝5.8)置于恒温箱黑暗培养，15到20天后,可以看到在外植体长出愈伤。

三、将柽柳愈伤转移至分化培养基(ms培养基+1.0mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂粉ph＝5.8)中置于温度25℃/23℃(白天/黑夜)，光照强度为500mmolm^-2s^-1，光周期为14h/10h的温室中继续培养，培养到20天左右观察可以看见愈伤组织上有绿芽点长出。

四、将愈伤组织长出的绿色芽点继续在分化培养基(ms培养基+1.0mg/l6-ba+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂粉ph＝5.8)上继代培养，20-30天后长至高1-2cm的不定芽。

五、将不定芽在超净工作台中剪掉，转移至生根培养基(ms培养基+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+6.0g/l琼脂粉ph＝5.8)中生根培养，7天左右会生根，45天后可以得到根系发达的刚毛柽柳无性繁殖组培苗。