专利名称：一种温莪术油提取物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及中药温莪术油提取物及其制备方法和用途，特别涉及一种含有倍半萜类成分的温莪术油提取物及其在制备治疗癌症的药物中的应用。
背景技术：
温莪术为姜科植物温郁金Curcuma wenyujin Y.H.Chen et C.Ling的干燥根茎，习称“温莪术”。温莪术药材、温莪术油及温莪术油的注射液为中国药典收载品种，温莪术油是一种经临床证明疗效确切的抗病毒、抗癌药(中国药典2005版)。中国药典收载的温莪术油一直是采用水蒸气蒸馏法提取，传统的生产工艺由于加热时间长，加热温度高，使得到的莪术油含杂质多，特别是活性成分主要为含氧环状倍半烯萜类化合物，它们在长时间高热条件下易发生转化，影响了莪术油的临床疗效和制剂稳定性。例如温莪术油抗癌主成分-呋喃二烯(Furanodiene，又名蓬莪术环二烯，分子式C15H20O)在100℃或100℃以上长时间加热过程中易发生周环化发应，生成莪术烯(6-甲二叉甲基-4，5，6，7-四氢-3，6-二甲基-5异丙烯基-反式-苯并呋喃)。莪术烯经家兔肌肉刺激性实验证实，莪术烯会产生一定的刺激性作用。此外，由于温莪术中含有较多的淀粉粒，在长时间的加热蒸馏过程中易与水蒸气、挥发油一起被蒸出，造成提取的挥发油中含有大量的泡沫，油水易形成乳浊液，难于分层，使得质量不稳定，存在热源不过关等问题，给挥发油的精制带来难度。因此提供一种质量稳定、无刺激性的温莪术油提取物具有深远的临床意义。
发明内容
本发明提供了一种温莪术油提取物，该提取物主要含有倍半萜类组分，其中呋喃二烯+吉马酮+莪术二酮在总油中的含量≥50％。
本发明提供了一种温莪术油提取物的制备方法。
本发明提供了一种温莪术油提取物的检测方法。
本发明提供了温莪术油提取物在制备治疗宫颈癌、喉癌、白血病、脑胶质瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的药物中的用途。
本发明提供的温莪术油提取物采用CO2超临界萃取方法制备将莪术药材粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪中，萃取压力为5～18Mpa，萃取温度20～55℃，分离釜I、II的压力为7～30Mpa，分离温度45～70℃，CO2的流量为20～100kg/h，萃取时间2～8h。
本发明提供的温莪术油提取物的检测方法为选用HPLC法和TLC法分离分析温莪术油中的有效成分及进行指纹图谱的研究，目的是由高效液相色谱法(HPLC)和薄层色谱法(TLC)代替气相色谱法(GC)或气相色谱-质谱联用法(GC-MS)分离分析温莪术油的成分，避免了气相色谱法(GC)或气相色谱-质谱联用法(GC-MS)中进样室和色谱柱的高温对温莪术油有效成分的破坏，而影响温莪术油成分的真实性。
本发明提供的温莪术油提取物中倍半萜类成分不受破坏，提高了提取率，质量稳定，不含莪术烯(6-甲叉亚甲基-4，5，6，7-四氢-3，6-二甲基-5异丙烯基-反式-苯并呋喃)，无刺激性，且其在抗宫颈癌、喉癌、白血病、脑胶质瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌中的效果显著。
图1为检测方法2中对照品的色谱图。
图2为制备例1得到的提取物的色谱图。
具体实施例方式 制备例1 取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到萃取釜(江苏南通华安超临界萃取有限公司产HA221-50-06型超临界CO2萃取装置)中，选择萃取压力18Mpa，萃取温度为55℃；分离釜I压力12Mpa，温度为55℃，分离釜II压力为7Mpa，温度为45℃；CO2流量为80～100kg/h，萃取时间2h，得到油210g，萃取率为14.0％。经高效液相色谱法分离分析(分析条件见检测方法2选用HPLC法定性定量分析莪术油中的有效成分及有关物质)，检测结果为呋喃二烯含量为31.3％，吉马酮(牻牛儿酮)含量为15.5％，莪术二酮含量为11.7％，色谱图见图2。
制备例2 取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪(江苏南通华安超临界萃取有限公司产HA221-50-06型超临界CO2萃取装置)中，选择17Mpa为超临界CO2萃取莪术油的萃取压力，温度为50℃；分离釜I压力10Mpa，温度为50℃，分离釜II压力为7.5Mpa，温度为60℃；CO2流量为25kg/h，萃取2.5h，得到莪术油198g，萃取率达到13.2％，其中呋喃二烯在温莪术油中的含量为33.8％，吉马酮(牻牛儿酮)含量为14.1％，莪术二酮含量为12.6％。
制备例3 取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪(江苏南通华安超临界萃取有限公司产HA221-50-06型超临界CO2萃取装置)中，选择15Mpa为超临界CO2萃取莪术油的萃取压力，温度为55℃；分离釜I压力12Mpa，温度为50℃，分离釜II压力为8Mpa，温度为63℃；CO2流量为25kg/h，萃取2.5h，得到莪术油191g，萃取率达到12.7％，其中呋喃二烯在温莪术油中的含量为30.4％，吉马酮(牻牛儿酮)含量为15.1％，莪术二酮含量为12.7％。
制备例4.温莪术油脂肪乳注射剂 将5.0g温莪术油提取物、100g注射用大豆油、12g注射用蛋黄磷脂、0.02g维生素E混合均匀后，置60℃恒温水浴搅拌至澄清油溶液；将2g泊洛沙姆188、22.5g注射用甘油溶解分散在800ml注射用水中，加热至60℃为水相；将上述油溶液与水相按一定比例置组织捣碎机中，分次以8000～10000rpm高速搅拌，制成初乳剂；然后迅速降温后，调整pH值8～9，用注射用水使乳剂成1000ml；再经高压均质机匀化后，用0.22μm微孔滤膜滤过，灌封，即得100支乳剂(每支含温莪术油提取物50mg/10ml)。
试验例1温莪术油提取物对人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3的作用(体外筛选，MTT法)。
1、材料 温莪术油提取物按制备例1方法制备；水蒸气蒸馏温莪术油(自提，依据《中国药典》2005版1部莪术油项下提取工艺制得)。
实验瘤株体外培养细胞人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3，购于中国科学院上海细胞库。
2.方法进行体外细胞增殖抑制实验(MTT活细胞染色法) 取对数生长期的人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3各株体外培养细胞(贴壁细胞用消化液消化)，台盼蓝排染法计数活细胞数，其中HL-60和SGC-7901用新鲜RPMI1640培养液，PC3用新鲜DMEM培养液，调整细胞密度为1×105个/ml，于96孔培养板内，每孔加细胞悬液200μL(每孔约2×104个)。在37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中将HL-60培养1h后，SGC-7901、PC3培养24h后加药处理。2种温莪术油以DMSO为溶剂；以灭菌的生理盐水为溶剂，配制成5档剂量组，试药组每孔加试液0.4μL，组每孔加试液2μL，空白对照组不加任何试液，每档样品设三复孔。在37℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养48h后，每孔加入8μL MTT液，继续培养4h后每孔加入100μL DMSO，置摇床摇匀至结晶全部溶解，选用Synergy HT酶联仪于570～630nm处测各孔吸光度值，将各加试液孔均值(T)与对照孔值(C)比较，以下列公式计算出各浓度组的百分抑制率[IC％＝(1-T/C)×100％]，并以此计算样品的回归方程，再求出各样品的IC50值。该试验重复3次以上，重复性 良好。结果见表1 表1数据说明温莪术油提取物对人早幼粒白血病HL-60、胃癌SGC-7901、前列腺癌PC3的体外增殖抑制作用明显高于参照组水蒸气蒸馏温莪术油。结果还表明温莪术油提取物对人早幼粒白血病HL-60体外增殖抑制作用最强。见表1 表1 温莪术油提取物体外抗癌的IC50值(MTT法) 肿瘤细胞类型 分组 回归方程 相关系数 IC50 (Y) (r) (μg/ml) 白血病细胞(HL-60) 温莪术油提取物 -1.587+20.447lnx 0.983612.47 7.5733+18.828lnx 0.99559.52 水蒸气蒸馏温莪术油 -2.574+15.263lnx 0.989831.33 1-5.492+17.214lnx0.996825.12 前列腺癌(PC3) 温莪术油提取物 -20.152+24.689lnx0.993817.14 -21.377+23.887lnx0.986819.85 水蒸气蒸馏温莪术油 -15.236+20.562lnx0.995923.87 -18.894+20.457lnx0.994829.01 胃癌(SGC-7901) 温莪术油提取物 -31.783+26.489lnx0.978521.92 -8.763+20.116lnx 0.986218.56 水蒸气蒸馏温莪术油 -40.259+22.481lnx0.988955.41 -42.351+25.459nx 0.989437.62 试验例2温莪术油提取物对人早幼粒白血病HL-60、人宫颈癌Hela、人喉癌Hep-2的作用(体外筛选，SRB法)。
1、材料温莪术油提取物按制备例1方法制备；水蒸气蒸馏温莪术油(自提，依据《中国药典》2005版1部莪术油项下提取工艺制得)； 实验瘤株体外培养细胞人早幼粒白血病HL-60、人宫颈癌Hela、人喉癌Hep-2细胞，购于中国科学院上海细胞库。
2.方法进行体外细胞增殖抑制实验(SRB法)。
采用SRB法测定上述2种温莪术油对3种人癌细胞增殖的体外抑制作用。分别取对数生长期的HL-60、Hela、Hep-2的人癌细胞，台盼蓝排染法计数活细胞数，HL-60用新鲜的RPMI1640培养液调整细胞密度都为3.0×105cell/mL，Hela、Hep-2用新鲜的RPMI 1640培养液调整细胞密度都为1.0×105cell/mL以每孔100μL接种于96孔板内。在37℃、体积分数5％的CO2饱和湿度培养箱中培养12h后加药处理。2种温莪术油提取物以DMSO-乙醇(体积比1:1)为溶剂，配制成5档剂量组，每孔加药100μL，每档样品设三复孔，以不接种细胞只加培养液的为空白对照。药物处理细胞48h后，细胞HL-60每孔各加入50μL、4℃预冷的体积分数80％的三氯醋酸，使其最终达到体积分数为16％。细胞Hela、Hep-2每孔各加入50μL，4℃预冷的体积分数50％的三氯醋酸，使其最终达到体积分数为10％。4℃冰箱固定细胞1h后，倒掉固定液，用去离子水冲洗96孔板5遍，空气干燥。经三氯醋酸固定后的细胞加入体积分数0.4％的SRB(磺酰罗丹明B)，每孔50μL，室温染色30min。用体积分数1％的醋酸冲洗96孔板5遍，空气干燥。最后加入10mmol.L-1Tris碱，每孔150μL，在微量振荡器上振荡15min，直至染料全部溶解，利用酶标仪在540nm处测每孔溶液的吸光度值(A值)、空白孔吸光度值。
将各加试液孔均值(T)与对照孔值(C)比较，以下列公式计算出各浓度组的百分抑制率[IC％＝(1-T/C)×100％]。并以此计算样品的回归方程，再求出各样品的IC50值。该试验重复3次以上，重复性良好。结果见表2。
表2数据表明温莪术油提取物对人喉癌Hep-2、人宫颈癌Hela、人早幼粒白血病HL-60细胞的体外增殖抑制作用明显高于参照组水蒸气蒸馏温莪术油。表2数据结果还表明温莪术油提取物对人喉癌Hep-2细胞的体外增殖抑制作用强于人宫颈癌Hela细胞，强于人早幼粒白血病HL-60细胞。且MTT法和SRB法试验结果都证实温莪术油提取物对人早幼粒白血病HL-60细胞有明显体外增殖抑制作用。
表2 温莪术油提取物体外抗癌的IC50值(SRB法) 回归方程 相关系数IC50 肿瘤细胞类型分组 (Y) (r) (μg/ml) 温莪术油提取物 8.9903+34.631lnx 0.9888 3.26 32.919+14.323lnx 0.9869 3.30 Hep-2 -10.254+18.569lnx 0.9852 25.66 水蒸气蒸馏温莪术油 -15.264+19.521lnx 0.9878 28.31 温莪术油提取物 7.2854+27.343lnx 0.9869 8.13 1.2256+26.441lnx 0.9923 6.94 Hela -18.882+19.526lnx 0.9854 33.82 水蒸气蒸馏温莪术油 -17.564+18.487lnx 0.9915 38.66 温莪术油提取物 -11.688+21.911lnx 0.9869 16.70 10.404+15.726lnx 0.9911 12.40 HL-60 -14.254+16.5611nx 0.9945 48.42 水蒸气蒸馏温莪术油 - 19.265+18.592lnx0.9926 41.49 试验例3温莪术油脂肪乳注射剂对人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞荷瘤裸鼠模型、小鼠宫颈癌U14实体瘤模型的生长抑制作用。
1药品温莪术油脂肪乳注射剂的制备见制备例4。水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂(依据《中国药典》2005版2部莪术油注射液项下制备工艺制得)。
2动物BALB/c2nu裸鼠40只，购自上海中国科学院实验动物中心，5～6周龄，雌雄各半，体重平均(21.27±0.80)g。无特定病原体条件饲养，保持一定湿度、温度(25～28℃)。所用食物、水、饲养笼和垫料均经高压消毒。昆明小鼠由山东绿叶制药有限责任公司动物中心提供(许可证号SYXK(鲁)20030020)体重18～20g。雌雄皆可，每批实验使用同一性别。动物数实验组、参照组及阴性对照组昆明小鼠均各为10只。
3瘤源喉鳞状细胞癌Hep-2、小鼠宫颈癌U14细胞株购于中国科学院上海细胞库。
4剂量设置 人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞荷瘤裸鼠模型温莪术油脂肪乳注射剂腹腔注射100(qd)、50(qd)和10(qd)mg/kg。参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂腹腔注射100(qd)mg/kg。
小鼠宫颈癌U14模型温莪术油脂肪乳注射剂腹腔注射100(qd)、50(qd)、10(qd)和50(bid)mg/kg。参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂腹腔注射100(qd)mg/kg。
5给药方案人喉鳞状细胞癌细胞株Hep-2细胞荷瘤裸鼠模型以剂量设置温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾腹腔100、50和10mg/kg注射给药，每3天腹腔给药1次，共给药8次。强化给药分别采用剂量设置的温莪术油脂肪乳注射剂的中剂量静脉输注输液小鼠腹腔注射给药，每3天腹腔给药，每天2次，共给药16次。以剂量设置参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射给药，每3天腹腔给药1次，共给药8次。
小鼠宫颈癌U14模型以剂量设置温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾腹腔100、50和10mg/kg注射给药，每天1次，连续9d，共给药9次。强化给药分别采用剂量设置的的中剂量静脉输注输液小鼠腹腔注射给药，每天2次，连续9d，共给药18次。参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂腹腔注射100(qd)mg/kg。以剂量设置参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾腹腔注射100mg/kg注射给药，每3天腹腔给药1次，共给药8次。
6实验对照阴性对照给与实验组高剂量等体积等浓度的相应溶剂，给药方案均为小鼠腹腔注射途径，每天1次，连续10d。
7实验方法 取体外培养对数生长的喉癌Hep-2细胞，每只裸鼠于右耳后下皮下种植1×109/L喉癌Hep-2细胞悬液0.2ml使之生长，建立喉癌裸鼠动物模型。观察接种部位液体吸收、肿瘤生长过程及裸鼠状况，待肿瘤生长25d，至直径>1cm时进行治疗。8组动物每3天腹腔给药1次，并称量鼠重，重新调整给药剂量。分别于1、4、7、10、13、16、19和22d给药。停药后3d，处死裸鼠，离肿瘤，称量瘤重和鼠重抑瘤率。
无菌抽取传代第8天的宫颈癌U14小鼠的腹水，以无菌生理盐水调整细胞数在8×106个/ml，于每鼠右侧腋窝皮下接种0.2ml，24小时后，腹腔注射给药，每天一次，连续给药9天，停药后24h称重，处死小鼠，分离瘤块，计算出抑瘤率。以t检验进行统计学处理。
按下列公式计算肿瘤抑制率 抑瘤率％＝(1-实验组平均瘤重/对照组平均瘤重)×100％。
8结果 (1)人喉鳞状细胞癌Hep-2模型的抑制率 温莪术油脂肪乳注射剂输液样品的剂量分别为100mg/kg、50mg/kg及10mg/kg，试验抑制率结果分别为55.23、50.35，41.85、43.22，20.14、22.53％；温莪术油脂肪乳注射剂采用低剂量50mg/kg强化方案给药，试验抑制率结果分别为60.59、62.82％。详细数据见表3。(2)小鼠宫颈癌U14模型的抑制率 温莪术油脂肪乳注射剂输液样品的剂量分别为100mg/kg ip×9qd、50mg/kg ip×9qd及30mg/kg ip×9qd，试验抑制率结果为41.55、40.55，33.68、28.61，21.51、22.99％；温莪术油脂肪乳注射剂采用低剂量50mg/kg iv×9bid强化方案给药，试验结果分别为46.39、47.02％。详细数据见表4。
温莪术油脂肪乳注射剂对人喉癌Hep-2裸鼠及小鼠宫颈癌U14两个模型试验显示温莪术油脂肪乳注射剂具有良好的抗肿瘤作用，三个治疗剂量间具有量效关系，采用同剂量但不同给药方案时，每天两次腹腔给药较一次腹腔给药效果好，甚至超过高剂量组。其在剂量100mg/kg的抗肿瘤效果是同剂量参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的2倍，要明显强于参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的抗肿瘤效果。水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂在剂量100mg/kg时近似于无效。
表3 温莪术油脂肪乳注射剂对人喉癌裸鼠模型的疗效试验 样品剂量 动物数(只) 瘤重 抑制率 mg/kg/d 始/终 X±SD(g)％ 阴性对照组 相应溶剂 10/10 1.855±0.157 10/10 1.987±0.143 10/10 0.830±.042*** 55.23 100 10/10 0.986±0.051***50.35 10/10 1.079±0.062***41.85 50 10/10 1.128±0.088***43.22 温莪术油脂肪乳注射剂 10/10 1.481±0.095***20.14 10 10/10 1.539±0.142***22.53 10/10 0.731±0.053***60.59 50 10/10 0.739±0.041***62.82 参照组10/10 1.336±0.101***27.98 100 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂 10/10 1.356±0.081***31.76 ***P值<0.01与阴性对照组相比 表4 温莪术油脂肪乳注射剂对小鼠U14宫颈癌实体瘤型的疗效试验 样品 剂量给药方案 动物数(只) 瘤重抑制率mg/kg/d始/终 X±SD(g) ％ 阴性对照组 相应溶剂 ip×9qd 10/10 3.381±0.424 10/10 3.567±0.98 温莪术油脂肪乳注射剂 100 ip×9qd 10/10 1.976±0.203*** 41.55 10/10 2.121±0.315*** 40.5550ip×9qd 10/10 2.242±0.425*** 33.68 10/10 2.546±0.241*** 28.6110ip×9qd 10/10 2.654±0.451*** 21.51 10/10 2.747±0.561*** 22.9950ip×9bid 10/10 1.813±0.078*** 46.39 10/10 1.890±0.065*** 47.02 参照组 100 ip×9qd 10/102.559±0.126*** 24.31 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂10/102.642±0.213*** 25.93 ***P值<0.01与阴性对照组相比 试验例4温莪术油脂肪乳注射剂对颅内接种的小鼠神经胶质瘤G-422及B16小鼠黑色素瘤实验肺转移的抗肿瘤疗效。
1药品温莪术油脂肪乳注射剂的制备见制备例4，水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂(依据《中国药典》2005版2部莪术油注射液项下制备工艺制得) 2动物C57BL/6小鼠、昆明小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号沪动合证字第107号。体重18～20g。雌雄皆可，每批实验使用同一性别。动物数实验组及参照组昆明小鼠均各为10只、阴性对照组20只。
3瘤源G-422小鼠脑瘤模型、B16小鼠黑色素瘤模型由上海医药工业研究院药理室传代维持。
4剂量设置温莪术油脂肪乳注射剂静脉注射40和20mg/kg。水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂静脉注射40mg/kg。
5给药方案以剂量设置温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾静脉40和20mg/kg注射给药，每天1次，连续10d，共给药10次。强化给药分别采用剂量设置的温莪术油脂肪乳注射剂的低剂量静脉输注输液小鼠尾静脉注射给药，每天2次，连续10d，共给药20次。参照水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂小鼠尾静脉40mg/kg注射给药，每天1次，连续10d，共给药10次。
6实验对照阴性对照给与实验组高剂量等体积等浓度的相应溶剂，给药方案均为小鼠尾静脉途径，每天1次，连续10d。
7实验方法颅内接种动物肿瘤模型取生长旺盛的小鼠G-422瘤源，无菌条件下匀浆法制备成约3～4×107/mL均浆，于昆明小鼠颅内接种0.05mL/鼠，分组，接种24h后开始静脉给药治疗。B16小鼠黑色素瘤模型取体外培养对数生长的B16小鼠黑色素瘤细胞，从C57BL/6小鼠尾静脉接种5×104个细胞。G-422观察荷瘤小鼠30天内的存活率，与阴性对照组比较，计算肿瘤抑制率；B16试验三周后取各组动物的肺脏，检查肺克隆数。
按下列公式求出荷瘤宿主的生命延长率 生命延长率(％)＝[(对照组平均生存天数-给药组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100％依据各组肿瘤平均集落数，按下列公式计算肿瘤抑制率 肿瘤抑制率(％)＝[(对照组平均集落数-给药组平均集落数)/对照组平均集落数]×100％ 统计学方法采用X2检验。
结果 颅内接种的小鼠神经胶质瘤G422对荷瘤宿主的生命延长率温莪术油脂肪乳注射剂高剂量40mg/kg iv×10qd及低剂量20mg/kg iv×10qd试验结果为53.61、55.99，48.45、50.83％；温莪术油脂肪乳注射剂采用低剂量20mg/kg iv×10bid强化方案给药，试验结果为58.06％。详细数据见表5。
B16小鼠黑色素瘤试验性肺转移模型的肿瘤抑制率温莪术油脂肪乳注射剂的高剂量40mg/kg iv×10qd及低剂量20mg/kg iv×10qd试验结果为43.93、40.99，36.76、39.83％；温莪术油脂肪乳注射剂采用低剂量20mg/kg iv×10bid强化方案给药，试验结果为48.06％。详细数据见表6。
温莪术油脂肪乳注射剂对颅内接种的小鼠G-422脑神经胶质瘤(脑内接种)及B16小鼠黑色素瘤实验肺转移两个模型试验结果显示温莪术油脂肪乳注射剂具有良好的抗肿瘤作用，其中对原位接种的脑神经胶质瘤效果更为显著，显示本品有通过血脑屏障的特点，两个治疗剂量间具有量效关系。采用同剂量但不同给药方案时，每天两次静脉给药较一次静脉给药效果好，甚至超过高剂量组。其中温莪术油脂肪乳注射剂对颅内接种的小鼠G-422脑神经胶质瘤的抗肿瘤效果在剂量40mg/kg/d的抗肿瘤效果是参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的2倍，表明其要明显强于参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的抗肿瘤效果。
表5 温莪术油脂肪乳注射剂对G-422小鼠神经胶质瘤的疗效试验 剂量 动物数 平均生存时间生命延长率 样品给药方案 mg/kg 始/终(只) X±SD(天)％ 阴性对照组 相应溶剂 iv×10qd20/0 9.71±2.2 iv×10qd20/0 9.68±2.2 10/0 14.9±3.1***53.61 40 iv×10qd 10/0 15.1±2.9***55.99 温莪术油脂肪乳注射剂 10/10 14.4±2.3***48.45 iv×10qd 20 10/0 14.6±1.8***50.83 iv×10bid 10/0 15.3±3.7***58.06 参照组 10/10 12.62±1.3*** 29.97 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂 40 iv×10qd 10/10 11.86±1.8*** 22.52 ***P值<0.01与阴性对照组相比 表6 温莪术油脂肪乳注射剂对小鼠黑色素瘤B16实验肺转移疗效试验 剂量动物数(只) 肺克隆数 抑制率 样品 给药方案 mg/kg/d 始/终 X±SD(个) ％ iv×10qd 20/20 48.5±11.3 阴性对照组 相应溶剂 iv×10qd 20/20 49.6±12.2 10/10 27.2±3.1*** 43.93 40 iv×10qd 10/10 29.3±2.7*** 40.99 温莪术油脂肪乳注射剂 10/10 30.7±23***36.76 iv×10qd 20 10/10 29.8±1.8*** 39.83 iv×10bid 10/10 25.8±3.4*** 48.06 参照组 10/10 28.4±2.2*** 41.44 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂 40 iv×10qd 10/10 30.5±3.0*** 38.51 ***P值<0.01与阴性对照组相比 试验例5温莪术油脂肪乳注射剂注射液对移植性P388白血病小鼠移植性和艾氏腹水癌(EAC)的体内抗肿瘤疗效。
1药品温莪术油脂肪乳注射剂的制备按制备例4。水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂(依据《中国药典》2005版2部莪术油注射液项下制备工艺制得)。
2动物昆明小鼠由上海中科院实验动物中心提供，合格证号沪动合证字第107号。体重18～20g。DBA/2小鼠，19±2g，由中国科学院上海实验动物中心提供(合格证号中科动005号)。雌雄皆可，每批实验使用同一性别。动物数实验组及参照组昆明小鼠均各为10只、阴性对照组20只。
3瘤源小鼠P388白血病瘤株模型和艾氏腹水癌瘤(EAC)模型由上海医药工业研究院药理室传代维持。
4剂量设置温莪术油脂肪乳注射剂静脉注射40和20mg/kg。水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂静脉注射40mg/kg。
5给药方案以剂量设置的温莪术油脂肪乳注射剂和水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂于接种后的24h、72h、120h小鼠腹腔40和20mg/kg给药，共给药3次。
6实验对照阴性对照给与实验组高剂量等体积的生理盐水，给药方案均为小鼠腹腔途径，每天1次，连续3d。
7实验方法 小鼠P388白血病瘤株模型取腹水生长旺盛的P388白血病小鼠，以艾氏腹水癌瘤EAC模型相同的方法，无菌条件下抽取腹水，用生理盐水1∶10稀释后，接种于DBA/2小鼠，每只小鼠腹腔接种0.2mL。于接种后24，72，120h腹腔注射给药3次。求得各组的平均生存天数，与阴性对照组比较，求出生命延长率。
艾氏腹水癌瘤EAC模型取健康状况良好，传代第7天的EAC荷瘤小鼠，颈椎脱臼处死，新洁尔灭浸泡消毒，无菌条件下抽取腹水，按1∶4加入无菌生理盐水制成细胞悬液，每只小鼠腹腔接种0.2mL[细胞数为(1～5)×106]。接种后，动物随机分组，每组10只，共分4组，于接种后的24h、72h、120h按实验设计方案给药。停药后观察小鼠的存活情况，求得各组的平均生存天数，与阴性对照组比较，按下列公式求出生命延长率 生命延长率(％)＝[(对照组平均生存天数-给药组平均生存天数)/对照组平均生存天数]×100％ 8结果 温莪术油脂肪乳注射剂对小鼠移植性肿瘤P388白血病模型试验显示使P388小鼠生存期显著延长，其平均存活时间和生命延长率与阴性对照组比较有显著差异，见表7。其在剂量40mg/kg/d的抗肿瘤效果是参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的5倍，要明显强于参照组水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂的抗肿瘤效果。
温莪术油脂肪乳注射剂对小鼠移植性艾氏腹水癌瘤(EAC)模型试验显示使EAC小鼠生存期显著延长，其平均存活时间和生命延长率与阴性对照组比较有显著差异，见表8。
表7 温莪术油脂肪乳注射剂对小鼠P388白血病的疗效试验剂量动物数平均生存时间 生命延长率 样品 mg/kg 始/终(只) X±SD(天) ％ 20/20 11.1±1.5 阴性对照组相应溶剂 20/20 10.4±2.5 10/10 16.5±1.9*** 48.65 40 温莪术油脂肪乳注射剂 10/10 15.6±2.2*** 50.00 20 10/10 12.6±1.5*** 13.51 10/10 13.1±1.6*** 25.96 参照组 10/10 12.1±1.0*** 9.01 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂 40 10/10 11.1±1.4***6.73 ***P值<0.01与阴性对照组相比 表8 温莪术油脂肪乳注射剂对艾氏腹水癌瘤EAC的疗效试验 样品 剂量 动物数 平均生存时间 生命延长率 mg/kg 始/终(只)X±SD(天) ％阴性对照组相应溶剂 20/0 9.8±2.320/0 10.8±2.0 温莪术油脂肪乳注射剂40 10/8 33.3±11.2*** 239.8010/8 30.6±13.2*** 183.33 20 10/8 20.4±13.5*** 108.1610/8 22.1±10.8*** 104.63 参照组 40 10/8 28.9±9.5***194.9 水蒸气蒸馏温莪术油脂肪乳注射剂 10/8 26.4±10.2*** 144.4 ***P值<0.01与阴性对照组相比 检测方法1选用薄层色谱法(TLC法)分离分析温莪术油中的成分 TLC温莪术油中主要成分的分离分析 TLC条件硅胶层析，展开剂为正己烷-乙酸乙酯(91)；显色剂为10％的硫酸乙醇溶液； 对照品 吉马酮(牻牛儿酮)由黑龙江省药品检验所提供； 莪术醇由中国药品生物制品检定所提供，批号100185-200405； 莪术二酮、呋喃二烯、莪术烯自提，纯度均大于98％，由有机波谱和单晶X-衍射确证结构和构型。
供试品制备例1、2、3中的温莪术油作为待测样品； 结果显示，制备例1、2、3中的温莪术油均含有吉马酮(牻牛儿酮)、莪术二酮、呋喃二烯、莪术醇等成分，基本不含有莪术烯。
检测方法2选用HPLC法定性定量分析温莪术油中的有效组分及有关物质 仪器美国Agilent 1100型HPLC仪 色谱条件Discovery C18HPLC Column25cm×4.6mm×5um；流动相乙腈-水(7525)或甲醇-水(90:10)； 检测波长215nm；柱温室温20～30℃；流速1ml/min；进样量20ul。
供试品制备例1中的温莪术油作为检测样品； 对照品 吉马酮(牻牛儿酮)由黑龙江省药品检验所提供； 莪术醇由中国药品生物制品检定所提供； β-榄香烯由大连医药科学研究所提供； 莪术二酮、呋喃二烯、莪术烯自提，纯度均大于98％，由有机波谱和单晶X-衍射确证结构和构型； 结果显示6个对照品在上述色谱条件下(流动相为甲醇-水(90:10))所得色谱图中的色谱峰从左到右分别为莪术二酮、莪术醇、吉马酮、莪术烯、呋喃二烯和β-榄香烯(见图1)，且6个对照品可达到完全分离，分离度均大于1.5；其中对制备例1中温莪术油检测结果见图权利要求
1.一种温莪术油提取物，该提取物主要含有倍半萜类组分，其中呋喃二烯+吉马酮+莪术二酮在总油中的含量≥50％。
2.根据权利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量为31.3％，吉马酮含量为15.5％，莪术二酮含量为11.7％。
3.根据权利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量为33.8％，吉马酮含量为14.1％，莪术二酮含量为12.6％。
4.根据权利要求1所述的提取物，其中呋喃二烯含量为30.4％，吉马酮含量为15.1％，莪术二酮含量为12.7％。
5.一种温莪术油提取物的制备方法，将莪术药材粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪中，萃取压力为5～18Mpa，萃取温度20～55℃，分离釜I、II的压力为7～30Mpa，分离温度45～70℃，CO2的流量为20～100kg/h，萃取时间2～8h。
6.根据权利要求5所述的方法，取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到萃取釜中，选择萃取压力18Mpa，萃取温度为55℃；分离釜I压力12Mpa，温度为55℃，分离釜II压力为7Mpa，温度为45℃；CO2流量为80～100kg/h，萃取时间2h，得到油210g，萃取率为14.0％。
7.根据权利要求5所述的方法，取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪中，选择17Mpa为超临界CO2萃取莪术油的萃取压力，温度为50℃；分离釜I压力10Mpa，温度为50℃，分离釜II压力为7.5Mpa，温度为60℃；CO2流量为25kg/h，萃取2.5h，得到莪术油198g，萃取率达到13.2％，
8.根据权利要求5所述的方法，取温莪术药材1.5kg，粉碎成20～40目的细粉，投入到超临界萃取仪中，选择15Mpa为超临界CO2萃取莪术油的萃取压力，温度为55℃；分离釜I压力12Mpa，温度为50℃，分离釜II压力为8Mpa，温度为63℃；CO2流量为25kg/h，萃取2.5h，得到莪术油191g，萃取率达到12.7％。
9.一种温莪术油提取物的检测方法，选用HPLC法和TLC法分离分析温莪术油中的有效成分及进行指纹图谱的研究。
10.温莪术油提取物在制备治疗宫颈癌、喉癌、白血病、脑胶质瘤、腹水癌、胃癌、前列腺癌的药物中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种温莪术油提取物及其制备、检测方法和用途。具体地涉及温莪术油提取物采用CO2超临界萃取方法制备。本发明提供的温莪术油质量稳定、可控，无刺激性，基本不含有莪术烯，同时有效成分提取完全，制备简单。本发明提供了温莪术油在制备治疗抗癌药物中的用途。
文档编号G01N30/02GK101433691SQ20071012890
公开日2009年5月20日 申请日期2007年7月27日 优先权日2006年8月1日
发明者孙秀燕 申请人:烟台大学