一种旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方法与流程

本发明涉及生物技术中植物种子无菌萌发与快速繁殖方法，具体地说涉及到旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方法。

背景技术：

旱地木槿hibiscusaridicolaanthony是隶属于锦葵科木槿属的美丽多花小灌木。旱地木槿是金沙江干热河谷特有种和地区标志种，仅分布于云南丽江和四川盐边地区，海拔高600-2500米的干热和干暖河谷中。由于分布点少于5个，种群持续衰退，2004年被列入《中国物种红色名录》濒危种类[enb2ab(ii)]。近年来，由于大坝建设，生境丧失，及人类活动的影响，该物种的生存环境受到严重威胁。

目前，生物技术中的无菌快速繁殖已成为中药材、花卉、濒危物种、经济林果等种苗生产的重要手段。

迄今为止，现有技术中未见有旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方面的报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，填补旱地木槿繁殖在生物技术上的空白，同时解决旱地木槿在野外分布区域狭窄，引种驯化难度大的问题。本发明为旱地木槿全面的开发和持续利用奠定了种苗繁育基础。

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，该方法包括外植体选择与消毒、种子无菌萌发培养、增殖与继代培养、壮苗与生根培养、瓶苗移栽步骤，

所述外植体选择与消毒是取旱地木槿略泛黄的饱满果实，用1％肥皂水浸泡10分钟，经流水冲洗干净后进行组培常规外植体消毒；

所述种子无菌萌发培养是：在种子无菌萌发培养基中暗培养7天后进行光照，光照强度为1000lux，温度为23～30℃，种子无菌萌发培养基为改良的ms培养基，将nh4no31650mg/l减少为400mg/l，kno3由1900mg/l减少为450mg/l，不加其他有机物，其余元素不变，20天后，种子开始萌发；

所述的增殖与继代培养是在增殖与继代培养基中培养，增殖与继代培养基为ms培养基+0.5mg/l6-ba+0.5mg/liaa+蔗糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，培养周期为30天；

所述的壮苗与生根培养是在壮苗与生根培养基中培养，壮苗与生根培养基为ms培养基+0.3mg/lnaa+0.3mg/liaa+蔗糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，培养周期20天；

所述的瓶苗移栽是：将生根瓶苗提前一周置放于大棚炼苗，准备基质，基质为体积比的珍珠岩∶腐殖土∶生红土＝1∶2∶3，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节ph至5.8，开瓶取苗，洗净基部培养基，移栽，及时喷水并覆盖塑料膜保湿，大棚温度为20～30℃，空气湿度50～60％，基质湿度75～85％。

根据所述的旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方法，所述外植体选择与消毒是取旱地木槿略泛黄的饱满果实为外植体，用1％肥皂水浸泡10min，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，用75％的酒精消毒15min，无菌水冲洗3遍后，去掉果皮，取出种子，用0.1％升汞溶液进行表面消毒5min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的旱地木槿种子萌发培养基中，每瓶5粒。

根据所述的旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方法，所述种子无菌萌发为全黑暗培养7天后进行人工辅助光诱导，光强度为1000lux，温度为23～30℃；增殖与继代、壮苗与生根培养的光照条件为人工辅光1500lux，温度为23～30℃。

根据所述的旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，增殖与继代培养基合二为一，壮苗与生根培养基合二为一，培养方法简化。

根据所述旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，生根瓶苗移栽前置于大棚炼苗适应一周后移栽在准备好的基质中。

根据所述旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，移栽基质为：体积比的珍珠岩∶腐殖土∶生红土＝1∶2∶3，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节ph至5.8，开瓶取苗，洗净基部培养基，移栽，及时喷水并覆盖塑料膜，大棚温度为20～30℃，遮光率75～85％，空气湿度50～60％，基质湿度75～85％，30天后成活率95％以上。

更具体地，本发明的方法可概括如下：

旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖的方法，包括选择外植体、消毒、诱导种子萌发，快繁增殖、壮苗生根及移栽步骤：

取旱地木槿略泛黄的饱满果实为外植体，用1％肥皂水浸泡10min，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，用75％的酒精消毒15min，无菌水冲洗3遍后，去掉果皮，取出种子，用0.1％升汞溶液进行表面消毒5min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的旱地木槿种子萌发培养基中，每瓶5粒。

旱地木槿种子萌发培养基的制备：因旱地木槿生存环境为干热河谷，土质较为贫瘠，多为砂壤。种子在改良的ms培养基中萌发率高，萌发时间短。改良ms培养基，将nh4no31650mg/l减少为400mg/l，kno3由1900mg/l减少为450mg/l，不加有机物，其余元素不变。暗培养7天后进行光照培养，光强度为1000lux，温度为23～30℃。20天后，种子开始萌发。

增殖与继代培养基为ms培养基+0.5mg/l6-ba(6-苄基嘌呤)+0.5mg/lnaa(奈乙酸)+蔗糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，培养周期30天。光强度为1500lux，温度为23～30℃。

壮苗与生根培养基为ms培养基+0.3mg/lnaa(奈乙酸)+0.3mg/liaa(吲哚乙酸)+糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，光强度为1500lux，温度为23～30℃，培养周期20天。

瓶苗移栽：培养20天后的生根瓶苗，需提前移至遮光率为75％～85％大棚炼苗一周。基质为珍珠岩：腐殖土：生红土(体积比)＝1：2：3，用800倍多菌灵进行喷施拌土，用塑料膜密封消毒7天，调节ph至5.8。开瓶取出种苗，洗净根部的培养基，移栽至消毒过的基质中，及时喷水并覆盖塑料膜保湿。大棚温度为20～30℃，遮光度在75％～85％，空气湿度50～60％，基质湿度75～85％。30天后成活率95％。

本发明技术方案的提出是基于下述的研究基础：

旱地木槿分布区域狭窄，为金沙江干热干暖河谷特有物种，种群持续衰退，人工引种驯化难度大。为解决其自然资源少，短时间内达到大量繁殖、保存和持续利用，填补旱地木槿在生物技术上的研究空白。故此发明了旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖技术，为旱地木槿全面的开发和持续利用奠定了基础。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1.本发明通过改良基础培养基配方，使得材料成活率较其他常用培养基提高43％。

2.本发明建立了有效的旱地木槿种子无菌萌发与快速繁殖方法，解决了其分布狭窄、引种驯化困难的状况，填补了旱地木槿繁殖在生物技术上的研发空白。

3.本发明通过无菌快繁得到的同一幼苗单株系后代，成苗容易，繁殖步骤简化，有效繁殖速率高，同时又保持了不同旱地木槿植株的优良性状系列。

4.本发明采用种子作为繁殖材料，极大化地保存了其后代的遗传多样性，为恢复旱地木槿种群遗传多样性和旱地木槿小种群保护、保存与开发利用提供前期基础，意义重大。

5.本发明的种子无菌萌发与快速繁殖方法繁育的旱地木槿在30天内增殖系数为5，生根率为98％，移栽成活率为95％，极大地提高了旱地木槿的繁殖系数，为该物种的引种驯化、保存、园林园艺及其商业价值的发挥利用提供了非常有效的方法。

附图说明：

图1为旱地木槿种子苗繁殖情况。

图2为旱地木槿旱地木槿种子苗生根情况。

具体实施方式：

下面结合附图，用本发明的实施例来进一步说明本发明的实质性内容和技术特点，但并不以此来限定本发明。

实施例1：

1.培养基及基质筛选：

取旱地木槿略泛黄的饱满果实为外植体，用1％肥皂水浸泡10min，经流水冲洗干净后，拿到超净台上，用75％的酒精消毒15min，无菌水冲洗3遍后，去掉果皮，取出种子，用0.1％升汞溶液进行表面消毒5min，无菌水清洗3～5次，接种于准备好的旱地木槿种子萌发培养基中，每瓶5粒。

将种子分别接种在ms、1/2ms、1/3ms、改良ms(接近1/4ms)培养基上，各培养基均不含有机物和激素，蔗糖30g/l，琼脂5g/l，ph5.8。暗培养基7天，光照培养13天后，统计种子萌发率。光强度为1000lux，温度为23～30℃。

表1种子无菌萌发培养基的筛选

对旱地木槿种子无菌萌发的培养基ms、1/2ms、1/3ms、改良ms(接近1/4ms)进行筛选，结果如表1，在改良ms(接近1/4ms)培养基上，萌发率达到60％，比常规的ms培养基萌发率高43％，为旱地木槿种子无菌萌发的最佳培养基。

以ms培养基为增殖与继代激素筛选的基本培养基，细胞分裂素均为6-ba，浓度范围为(0.1mg/l，0.5mg/l，2个浓度梯度)，生长素浓度分别为(0.1mg/l,0.5mg/l，2个浓度梯度)，采用均匀设计法进行，结果如表2：

表2继代与增殖培养激素的筛选

ms培养基+0.5mg/l6-ba(6-苄基嘌呤)+0.5mg/lnaa(奈乙酸)+蔗糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，培养周期30天，光强度为1500lux，温度为23～30℃。芽节数量(包含顶芽)5，植株叶片伸展，生长速度最快，株高6.4cm，茎粗3mm，愈伤组织较小。

表3生根培养基激素筛选结果

ms培养基+0.3mg/lnaa(奈乙酸)+0.3mg/liaa(吲哚乙酸)+蔗糖30g/l+琼脂5g/l，ph5.8，培养周期20天，生根率达98％。

表4栽培基质的筛选实验结果

实验④中三种基质配合，增加了基质疏松度和根部透气性，也为根部提供足够的营养，同时红土为土层深部土壤，带菌量较少，有利于无菌种苗的生长。30天后移栽成活率达到95％。

以上通过实施例形式对本发明的上述内容再作了进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于上面的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的保护范围。