本发明属于定云杉种植技术领域，尤其涉及一种康定云杉茎段组培快繁方法。
背景技术：
定云杉(piceamontigena)为中国物种红色名录中定为极危种类，国家二级重点保护植物。分类上属于松科、云杉属，树皮深灰色，呈不规则的厚片深裂。1a生枝淡褐色或褐色，被短柔毛，2a生和3a生枝灰褐色，冬芽圆锥形或状圆锥形，具树脂。叶扁四棱棱状条形，长0.6～1.3cm，宽约1.5mm，先端类，上面每边有4～7条白色气孔线，下面每边有1～4条完整或不完整的白色气孔线。球果圆柱形，长5～9cm，径3～4cm。成熟前种鳞背部绿色，上部边缘红色或紫红色，成熟时呈褐色，种鳞菱状卵形，露出部分近三角形边缘微具细缺齿。花期4～5月，球果9～10月成熟。由于该树种分布在海拔3100m～3400m的沟谷地带，数量极为稀少，种子采集十分困难，种子发芽率低，野外调查未发现自然更新的幼树。
综上所述，现有技术存在的问题是：康定云杉数量极为稀少，种子采集十分困难，种子发芽率低。目前采用扦插和种子繁殖等方式，成活率低，材料获取困难，不能大量繁育种苗。
技术实现要素：
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种康定云杉茎段组培快繁方法。
本发明是这样实现的，从外植体获取便利、消耗少、繁殖速度快等几个方面考虑，确定了茎段组培快繁的思路。一种康定云杉茎段组培快繁方法，所述康定云杉茎段组培快繁方法包括以下步骤：
步骤一，外植体采用康定云杉当年生茎段；采集康定云杉健壮植株的带节茎段，将叶片摘除，用自来水冲洗干净；
步骤二，先用70％乙醇消毒10s，用0.1％hgcl2浸泡6min；
步骤三，用无菌手术刀将材料切成带茎节的小茎段按极性接种在芽诱导培养基上；以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基；基本培养基中添加植物生长调节剂浓度设为6-ba1.0mg·l-1+naa0.1mg·l-1；
步骤四，继代培养以gd为基本培养基，最初继代，6-ba浓度1.0mg·l-1、0.5mg·l-1。然后6-ba浓度直接降到0.1mg·l-1，继代3-4次；
步骤五，以gd+蔗糖2％+iba0.1-0.3mg·l-1为生根培养基；
步骤六，有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，揭开封口膜，用镊子夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min；用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，保湿遮荫。
进一步，以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基，在光照时间12h·d-1，光强40μmol·m-2·s-1条件下培养。
进一步，所述培养基中附加2％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，ph5.8；培养温度为25±2℃，光照时间12h/d，光照强度为1500～2000lx。
进一步，所述保湿遮荫后需要1周再浇水1次，15d喷施1次营养液，常规管理。
进一步，所述基质体积比为蛭石∶腐殖土∶碳化稻壳＝1：0.5：0.5。
本发明的另一目的在于提供一种利用所述康定云杉茎段组培快繁方法的康定云杉。
本发明的优点及积极效果为：以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基，在光照时间12h·d-1，光强40μmol·m-2·s-1条件下培养，诱导率较高(92.6％)，芽的生长速度也较快。继代培养以gd为基本培养基，随着继代次数的增加逐渐减少细胞分裂素6-ba浓度；最初继代，6-ba浓度1.0mg·l-1、0.5mg·l-1。然后6-ba浓度直接降到0.1mg·l-1，继代3-4次，芽的增殖系数可以达到4-5，培养期间无玻璃化和褐变现象。以gd+蔗糖2％+iba(0.1-0.3)mg·l-1为生根培养基，诱导效果较好，生根率可达45％。30d后，苗的成活率达到90％，新根发早，根系发达、粗壮，植株生长良好。
本发明利用组织培养技术繁殖苗木，不受季节、时间的影响，可大大提高繁殖系数和工作效率，进行规模化和商业化生产；以往扦插繁殖方法，需要消耗大量枝条，损伤母株；种子繁殖材料来源少、发芽率低，能获取种苗数量也很少。通过茎段培养，能短时间内获得大量种苗。
本发明采用单因子试验和正交试验，通过培养基营养条件对康定云杉植株再生的影响，用生长诱导值来综合评估愈伤组织诱导及生长过程中的情况，能在短期内准确筛选出适宜培养基，且可靠性高。
附图说明
图1是本发明实施例提供的康定云杉茎段组培快繁方法流程图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
如图1所示，本发明实施例提供的康定云杉茎段组培快繁方法包括以下步骤：
s101：外植体采用康定云杉当年生茎段(春季萌动前)；采集康定云杉健壮植株的带节茎段，将叶片摘除，用自来水冲洗干净；在超净工作台上；
s102：先用70％乙醇消毒10s，用0.1％hgcl2浸泡6min；
s103：用无菌的手术刀将材料切成带茎节的小茎段按极性接种在芽诱导培养基上；以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基；基本培养基中添加植物生长调节剂浓度设为6-ba(1.0mg·l-1)+naa(0.1)mg·l-1)；
s104：继代培养以gd为基本培养基，最初继代，6-ba浓度1.0mg·l-1、0.5mg·l-1。然后6-ba浓度直接降到0.1mg·l-1，继代3-4次，芽的增殖系数可以达到4-5；
s105：以gd+蔗糖2％+iba(0.1-0.3)mg·l-1为生根培养基；
s106：将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min；再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫；1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，进行常规管理。
下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
(1)采样
外植体采用康定云杉当年生茎段(春季萌动前)。采集康定云杉健壮植株的带节茎段，将叶片摘除，用自来水冲洗干净。在超净工作台上。
(2)消毒处理及芽的诱导
先用70％乙醇消毒10s，然后用0.1％hgcl2浸泡6min，消毒效果较好，无菌率达到87.5％。，最后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面的水分，然后用无菌的手术刀将材料切成带茎节的小茎段按极性接种在芽诱导培养基上。
外植体消毒处理条件试验：采回幼嫩枝条进行不同消毒试验处理，接种15d后调查污染率，详见表1：
表1
以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基，在光照时间12h·d-1，光强40μmol·m-2·s-1条件下培养，诱导率较高(92.6％)，芽的生长速度也较快。
将处理好的无菌茎尖接种在gd、ms、1/2ms、dcr、wpm、n6培养基，各培养基里添加的植物生长调节剂浓度设为6-ba(1.0mg·l-1)+naa(0.1)mg·l-1)，共6个处理，培养60d后，调查诱导率和芽的形成能力，结果表2：
表2
gd为基本培养基，不同浓度的植物生长调节剂6-ba与naa的组合对腋芽诱导的影响。培养60d后，调查诱导率、愈伤程度和芽体生长情况。结果见表3：
表3
(3)继代增殖
继代培养以gd为基本培养基，随着继代次数的增加逐渐减少细胞分裂素6-ba浓度。最初继代，6-ba浓度1.0mg·l-1、0.5mg·l-1。然后6-ba浓度直接降到0.1mg·l-1，继代3-4次，芽的增殖系数可以达到4-5，培养期间无玻璃化和褐变现象。
(4)生根培养
培养基、植物生长调节剂(naa、iba)对康定云杉继代苗的诱导生根均有影响。以gd+蔗糖2％+iba(0.1-0.3)mg·l-1为生根培养基，诱导效果较好，生根率可达45％。
表4
(5)培养条件
以上所述培养基中均附加2％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，ph5.8，按植物组织培养常规方法配制和灭菌。培养温度为(25±2)℃，光照时间12h/d，光照强度为1500～2000lx。
(6)炼苗与移栽
将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，后揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒3-5min，然后再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫。1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，进行常规管理。10d后苗高可伸长2cm。30d后，苗的成活率达到90％，新根发早，根系发达、粗壮，植株生长良好。基质体积比配方：蛭石∶腐殖土∶碳化稻壳(1：0.5：0.5)。
表5
下面结合具体实施例对本发明的应用原理作进一步的描述。
实施例1：
(1)采样
外植体采用康定云杉当年生茎段(春季萌动前)。采集康定云杉健壮植株的带节茎段，将叶片摘除，用自来水冲洗干净。在超净工作台上。
(2)消毒处理及芽的诱导
先用70％乙醇消毒10s，然后用0.1％hgcl2浸泡6min，消毒效果较好，无菌率达到87.5％。，最后用无菌水冲洗5次，无菌滤纸吸干表面的水分，然后用无菌的手术刀将材料切成带茎节的小茎段按极性接种在芽诱导培养基上。
以gd+6-ba1.0mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖2％为基本培养基，在光照时间12h·d-1，光强40μmol·m-2·s-1条件下培养，诱导率较高(92.6％)，芽的生长速度也较快。
(3)继代增殖
继代培养以gd为基本培养基，随着继代次数的增加逐渐减少细胞分裂素6-ba浓度。最初继代，6-ba浓度1.0mg·l-1、0.5mg·l-1。然后6-ba浓度直接降到0.1mg·l-1，继代3-4次，芽的增殖系数可以达到4-5，培养期间无玻璃化和褐变现象。
(4)生根培养
培养基、植物生长调节剂(naa、iba)对康定云杉继代苗的诱导生根均有影响。以gd+蔗糖2％+iba(0.1-0.3)mg·l-1为生根培养基，诱导效果较好，生根率可达45％。
(5)培养条件
以上所述培养基中均附加2％蔗糖、0.7％琼脂粉和0.05％活性炭，ph5.8，按植物组织培养常规方法配制和灭菌。培养温度为(25±2)℃，光照时间12h/d，光照强度为2000lx。
(6)炼苗与移栽
将有生根组培苗的培养瓶放置于室温自然光照条件下炼苗3-5d，后揭开封口膜，用镊子轻轻夹出小苗，在自来水下冲洗干净基部残留的培养基，用0.1％的多菌灵溶液消毒5min，然后再用清水洗净，栽种到预先消毒处理过的基质中，基质用营养钵分装，每钵栽种1株，浇水淋透，适当保湿遮荫。1周后再浇水1次，15d喷施1次营养液，进行常规管理。10d后苗高可伸长2cm。30d后，苗的成活率达到90％，新根发早，根系发达、粗壮，植株生长良好。基质体积比配方：蛭石∶腐殖土∶碳化稻壳(1：0.5：0.5)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。