本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及黄粱木茎段为材料诱导愈伤和愈伤再生的方法。
背景技术：
黄梁木(neolamarckiacadamba)是一种有独特经济价值的茜草科(rubiaceae)团花属植物，其主要生长在南亚和东南亚，最近已被引进到哥斯达黎加，波多黎各，南非，苏里南，委内瑞拉等热带和亚热带国家，而在中国主要分布于广东、广西、云南、福建等华南地区和台湾。它是一种典型的多功能植物，其材质好，木材淡黄色，纹理通直，可作家具、建材、人造纤维、胶合板等原料；花是良好蜜源，果实可以食用，树皮、茎、根提取物可用做香料精及治疗蛇咬伤、糖尿病、发烧、贫血、霍乱等多种疾病；枝叶可做家畜饲料；黄梁木全身是宝，被人们誉为“宝石之树”和“奇迹树”，是一种极具发展前景的乡土阔叶树种。
目前黄粱木主要是通过播种育苗繁育，但种子不耐贮藏，一年后种子活力就下降，随着贮藏时间延长，种子萌发率越来越低，而且这种方式获得的幼苗生长慢，高度参差不齐，个体分化大，育苗周期长。另外，黄梁木植株的嫩枝和顶芽对低温较敏感，在12h的-2℃低温下就产生冻害甚至死亡，严重影响植株生长和树干的通直度，所以，黄梁木在国内仅分布于中国华南地区。为了使黄粱木的分布更广，国内外开始对提高黄粱木种苗繁殖率进行深入研究，想通过组织培养的方式可以解决黄粱木抗寒性差问题，随着黄粱木全基因组测序的完成，黄粱木育种也必将进入分子育种时代，黄粱木遗传转化体系的构建显得尤为重要，而高效的再生体系是遗传转化体系构建的前提。
关于黄粱木的组织培养，国内外已有几篇成功报道，主要以带腋芽的茎段、萌芽条作为外植体分别诱导出腋芽和顶芽,进而增殖、生根和移栽，但黄梁木茎段和萌芽条的髓部均为疏松的填充物，极易带有病菌，很难彻底消毒，且通过茎段和萌芽条外植体获得无菌苗的机率极低，效率不高，技术很不稳定，所以，利用黄梁木无菌茎段为外植体，通过组织培养技术建立稳定、可靠的植株高效再生技术体系，不仅能满足市场对种苗需求，而且可以通过转基因途径对黄梁木种质资源进行改良和创新，为黄梁木种质资源可持续利用奠定基础。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种以黄粱木茎段为外植体的操作更简便、取材更广泛的高效的黄粱木组培繁育方法，利用该方法能够在短期内快速获得大量优质的黄粱木种苗。
本发明所采用的技术方案：一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，其特征在于：包括如下步骤：
s1：无菌苗的获得：将种子置于37℃-40℃恒温摇床上震荡浸泡24-36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％naclo溶液灭菌12-15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；
s2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，15-25d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种培养，培养15-28天后，切取茎段作为外植体；
s3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导愈伤，接种时茎段垂直插入培养基；培养15-25d后，茎段上开始由黄绿色愈伤变成绿色芽点时，将外植体诱导不定芽伸长；
s4：生根培养：待不定芽伸长到3-4cm时，切取不定芽进行诱导生根；
s5：炼苗及移栽：生根培养20d后，不定芽长出多条根，将培养苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将培养苗在自来水中浸泡2h，移栽到经灭菌的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。步骤s1中，具体为将种子播种于ms培养基中培养，所述ms培养基为不含任何激素的ms培养基中培养，培养基ph值为5.8。
步骤s2中，具体为将无菌苗切断接种到添加ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养。
步骤s3中，具体为将外植体接种到添加tdz1-7mg/l+ba1-2mg/l+2,4-d0.5-0.1mg/l+iba0.5-0.1mg/l+蔗糖25g/l+琼脂5g/l的ms培养基中诱导不定芽。
步骤s3中，具体为将外植体转移到添加ba1-3mg/l+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖25g/l+琼脂5g/l的ms培养基中诱导不定芽伸长。
步骤s1中，培养温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s3中，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s4中，具体为接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的生根培养基中诱导生根，培养基ph为5.8。
步骤s4中，培养基ph为5.8，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明的高效组织培养和植株再生方法，可摆脱外界条件的影响，规模化和工厂化生产出健壮、整齐一致的黄粱木组培幼苗；与已经报道的以下胚轴、带腋芽的茎段、萌芽条作为外植体构建再生体系相比，具有操作方便、取材广泛、可重复性强、成苗多及效率高等优势。其具体意义在于：第一，一个茎段形成的愈伤团后50天内可以产生98棵苗，而高效的植物再生方法是其成功遗传转化的第一步；第二，愈伤形成的小苗优于增殖苗，其苗的生长状态更佳，如茎粗叶绿且大，不会像增殖苗那样出现茎细叶长；第三，愈伤形成的小苗，放到生根培养基中，第8天开始萌根，生根率到达100％；第四，在茎段放到愈伤诱导培养基第8-15天时，茎段开始脱分化，呈现水质感，此时的茎段会出现黄白色的初级愈伤阶段，此状态愈伤十分适合用来做转染材料；第五，本方法具有操作方便、取材广泛、可重复性强、成苗多及效率高优势。
因此该方法不仅能满足市场对种苗的需求，并且可以通过转基因研究对黄粱木种质资源进行改良和创新，为黄粱木种质资源可持续利用奠定基础。
附图说明
图1为实施例四步骤s2中切断种子苗培养20天后，切取的茎段外植体；
图2为实施例四步骤s3在ms+tdz2.5mg/l+ba1mg/l+2,4-d0.1mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖25g/l+琼脂5g/l愈伤诱导培养上培养20d的茎段愈伤；
图3为实施例四步骤s3在ms+tdz2.5mg/l+ba1mg/l+2,4-d0.1mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖25g/l+琼脂5g/l愈伤诱导培养上培养30d的茎段外植体上的愈伤块；
图4为实施例四步骤s3在ba3mg/l+naa0.3mg/ll+蔗糖25g/l+琼脂5g/l不定芽伸长培养基上培养7d伸长的不定芽；
图5为实施例四步骤s3在ba3mg/l+naa0.3mg/l+蔗糖25g/l+琼脂5g/l不定芽伸长培养基上培养14d伸长的不定芽；
图6为实施例四步骤s3在ba3mg/l+naa0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l不定芽伸长培养基上培养50d伸长的不定芽；
图7为实施例四步骤s4在ms+naa0.1mg/l生根培养基上培养10d伸长的根；
图8为实施例四步骤s5在ms+naa0.1mg/l生根培养基上生根培养20d伸长的根；
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。
实施例一
一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：
s1：无菌苗的获得：将种子置于37℃-40℃恒温摇床上震荡浸泡24-36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％naclo溶液灭菌12-15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；
s2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，15d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种培养，培养15天后，切取茎段作为外植体；
s3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导不定芽，接种时茎段垂直插入培养基；培养15-25d后，茎段上开始有愈伤出现，将外植体诱导不定芽伸长；
s4：生根培养：待不定芽伸长到3cm时，切取不定芽进行诱导生根；
s5：炼苗及移栽：生根培养20d后，不定芽长出多条根，将培养苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将培养苗在自来水中浸泡2h，移栽到经灭菌的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。
步骤s1中，具体为将种子播种于ms培养基中培养，所述ms培养基为不含任何激素的ms培养基中培养，培养基ph值为5.8。
步骤s2中，具体为将无菌苗切断接种到添加ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养。
步骤s3中，具体为将外植体接种到添加tdz1-7mg/l+ba1-2mg/l+2,4-d0.5-0.1mg/l+iba0.5-0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽。
步骤s3中，具体为将外植体转移到添加ba1-3mg/l+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽伸长。
步骤s1中，培养温度25℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s3中，培养条件为温度25℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s4中，具体为接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的生根培养基中诱导生根，培养基ph为5.8。
步骤s4中，培养基ph为5.8，培养条件为温度25±2℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
实施例二
一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：
s1：无菌苗的获得：将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％naclo溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；
s2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，25d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种培养，培养28天后，切取茎段作为外植体；
s3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导不定芽，接种时茎段垂直插入培养基；培养15-25d后，茎段上开始有愈伤出现，将外植体诱导不定芽伸长；
s4：生根培养：待不定芽伸长到4cm时，切取不定芽进行诱导生根；
s5：炼苗及移栽：生根培养20d后，不定芽长出多条根，将培养苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将培养苗在自来水中浸泡2h，移栽到经灭菌的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。
步骤s1中，具体为将种子播种于ms培养基中培养，所述ms培养基为不含任何激素的ms培养基中培养，培养基ph值为5.8。
步骤s2中，具体为将无菌苗切断接种到添加ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养。
步骤s3中，具体为将外植体接种到添加tdz1-7mg/l+ba1-2mg/l+2,4-d0.5-0.1mg/l+iba0.5-0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽。
步骤s3中，具体为将外植体转移到添加ba1-3mg/l+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽伸长。
步骤s1中，培养温度27℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s3中，培养条件为温度27℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s4中，具体为接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的生根培养基中诱导生根，培养基ph为5.8。
步骤s4中，培养基ph为5.8，培养条件为温度27℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
实施例三
一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：
s1：无菌苗的获得：将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％naclo溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；
s2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，20d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种培养，培养22天后，切取茎段作为外植体；
s3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导不定芽，接种时茎段垂直插入培养基；培养20d后，茎段上开始有愈伤，将外植体诱导不定芽伸长；
s4：生根培养：待不定芽伸长到3.5cm时，切取不定芽进行诱导生根；
s5：炼苗及移栽：生根培养20d后，不定芽长出多条根，将培养苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将培养苗在自来水中浸泡2h，移栽到经灭菌的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。
步骤s1中，具体为将种子播种于ms培养基中培养，所述ms培养基为不含任何激素的ms培养基中培养，培养基ph值为5.8。
步骤s2中，具体为将无菌苗切断接种到添加ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养。
步骤s3中，具体为将外植体接种到添加tdz1-7mg/l+ba1-2mg/l+2,4-d0.5-0.1mg/l+iba0.5-0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽。
步骤s3中，具体为将外植体转移到添加ba1-3mg/l+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽伸长。
步骤s1中，培养温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s3中，培养条件为温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s4中，具体为接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的生根培养基中诱导生根，培养基ph为5.8。
步骤s4中，培养基ph为5.8，培养条件为温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
实施例四
一种以黄粱木茎段为外植体的高效再生方法，包括如下步骤：
s1：无菌苗的获得：将种子置于40℃恒温摇床上震荡浸泡36h；在无菌超净台上，用75％酒精灭菌30s，无菌水冲洗3次，10％naclo溶液灭菌15min，无菌水彻底冲洗6次，将种子播种培养；
s2：茎段的伸长以及获得：种子培养7d开始萌芽，20d后生长成无菌苗，把无菌苗切断接种于ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养，培养20天后，切取茎段作为外植体(如图1)；
s3：茎段的诱导及伸长：将外植体诱导愈伤，接种时茎段垂直插入tdz2.5mg/l+ba1mg/l+2,4-d0.1mg/l+iba0.1mg/l+蔗糖30g/l+琼脂5g/l的ms培养基培养基；培养20d后，茎段上开始有愈伤形成(如图2)，茎段形成愈伤的概率达到66.7％，培养30天后，将形成的带芽点愈伤(如图3)，放置于ba3mg/l+naa0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中，7天后愈伤开始萌芽(如图4)，14天后芽陆陆续续开始萌发并长大(如图5)；50天后，萌芽率达到99％，每个愈伤有96棵芽(如图6)；
s4：生根培养：待不定芽伸长到3.5cm时，切取不定芽放置于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中进行诱导生根10天后，不定根生开始形成，根率达到98％，平均生根8.2条，平均根长0.83cm(如图7)
s5：炼苗及移栽：生根培养20d后，不定芽长出多条根(如图8)，将培养苗从培养瓶中挖出，洗净根上的培养基，将培养苗在自来水中浸泡2h，移栽到经灭菌的泥炭土上，在营养杯上套上塑料袋保湿，3d后慢慢地移开塑料袋，按生长需求浇水。
步骤s1中，具体为将种子播种于ms培养基中培养，所述ms培养基为不含任何激素的ms培养基中培养，培养基ph值为5.8。
步骤s2中，具体为将无菌苗切断接种到添加ba1mg/l+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中培养。
步骤s3中，具体为将外植体接种到添加tdz1-7mg/l+ba1-2mg/l+2,4-d0.5-0.1mg/l+iba0.5-0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽。
步骤s3中，具体为将外植体转移到添加ba1-3mg/l+naa0.1-0.3mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的ms培养基中诱导不定芽伸长。
步骤s1中，培养温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s3中，培养条件为温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
步骤s4中，具体为接种于ms+naa0.1mg/l+蔗糖25-30g/l+琼脂5-6g/l的生根培养基中诱导生根，培养基ph为5.8。
步骤s4中，培养基ph为5.8，培养条件为温度26℃，光照强度2500lx，光照时间12h。
对于本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及变形，而所有的这些改变以及变形都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。