本发明涉及植物育种领域，具体涉及无种质基因型限制的高频体胚再生培养基及其应用。
背景技术：
结缕草属(zoysiagenus)植物主要分布于亚洲东部广大区域内，其南北跨约20个纬度，东西占30个经度；在我国主要分布区域从东北辽宁到南方广西等地的沿海狭长地带。由于结缕草生态环境复杂多样，其典型严格的异花授粉特性，导致了结缕草种间杂交及天然杂种大量存在，种内变异很大，也使得天然野生种群个体间保持了丰富的自然变异、基因型差异及遗传多样性。
结缕草以其高的耐践踏性、对紧实土壤的强适应性及高弹性、强抗旱耐瘠薄性和耐盐碱性及适宜低养护粗放性管理等特性而成为高质量足球场及运动场草坪的首选，及发展潜力巨大的优良生态、固土护坡及水土保持的草地植物；也成为世界公认的优良草坪草；我国结缕草种质资源位居世界首位，也是世界上唯一生产野生结缕草种子并具有出口创汇能力的国家。鉴于结缕草的优良特性，美国、日本等发达国家率先进行了新品种的常规选培育，但目前结缕草在生产上的使用大多还是以野生资源为主，育成品种(除兰引3号外)的广泛应用还很少见到。
利用生物技术结合常规育种方法进行结缕草新品种的选培育，既是提高结缕草育种效率的有效途径，也属世界育种前沿。采用生物技术进行品种或种质基因型改良及种质快繁最有效的途径就是建立高频体细胞胚再生技术体系；因为体细胞胚是单细胞起源的，体细胞胚再生途径不但重演了合子胚形态发生的过程，实现了再生种子的来源，也是种质保存、种苗脱毒快繁、诱导体细胞变异或基因转化的理想受体；体细胞胚快繁除能保证优良种群个体基因型的遗传一致性和稳定性，还能保持新种质的特异性。所以，体细胞胚再生技术也是植物组培克隆中最具吸引力的研究方向。
从理论上讲，各种植物的体细胞都具有全能性,在离体培养中通过体细胞胚胎发生途径均可形成再生植株，然而事实上有些植物容易，有些植物很难，主要是直到现在人们对这些植物的再生培养条件也还没有完全了解与掌握。草坪草也像许多单子叶植物一样被认为是很难利用体细胞胚胎发生途径诱导再生植株，特别是一些暖季型草坪草相关报道很少。通常大部分草坪草在较高浓度的生长素和较低浓度的细胞分裂素的固体培养基上就能形成愈伤组织,但是否能诱导出胚性愈伤组织及胚性愈伤组织中的胚性细胞是否能够通过体细胞胚胎发育途径形成胚状体则与外植体的年龄、生理状态、培养基的组成、激素的种类和浓度、培养条件等有关。其中，培养基的组成、激素的种类和浓度是培养条件的关键因子，合适的培养条件就是在适合的培养基上适时附加合适的激素及适量的浓度，从而达到植物在相应分化的阶段对生长发育的需要。激素对不同种类植物的生理效应有着相互促进或相互抵抗的效果，其影响涉及激素的合成、运输、代谢和效应等各个方面。植物细胞生长和分化的调节往往是多种激素综合作用的结果，而且它们之间的相互作用极其复杂。
据报道，结缕草是禾本科中较难培养的物种，大部分研究选择的材料是以1～3个种或种质基因型为主，牵涉的种质基因型数量较少；组培再生多以多细胞的器官发生途径为主；且从愈伤组织变成胚性愈伤组织及再生植株都较困难，组培再生率低，再生过程长。有些研究提到结缕草体细胞胚的产量和质量依赖于对培养基组成和植物激素等条件的优化，但至今也没有见到通过体细胞胚胎发生途径建立结缕草高频体胚再生体系的报道，也没有见到建立结缕草不同种质基因型的高频体细胞胚再生技术的报道。所以上述研究既不能解决结缕草种质基因型限制的问题，也没有牵涉到结缕草不同种质基因型高频体胚再生的问题，这些问题也成为结缕草生物技术育种与优良种质快繁的瓶颈。因此，建立结缕草无种质基因型限制的高频体胚再生培养技术是实现结缕草种质改良与优良种质高效利用的关键因子，具有重要的现实意义。
技术实现要素：
发明目的：为了克服现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了一种体细胞胚诱导培养基。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种胚状体增殖生长组合培养基。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种无种质基因型限制高频体胚再生培养基。
本发明还要解决的技术问题是提供了体细胞胚诱导培养基、胚状体增殖生长组合培养基和无种质基因型限制高频体胚再生培养基的应用。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种体细胞胚诱导培养基，包括改良ms培养基、2～4mg/l2,4-d、0.1～0.2mg/lnaa、0.05～0.1mg/l6-ba、40～50g/l蔗糖、0.6～0.7％琼脂，ph值为5.8～6.0。
其中，所述改良ms培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂。
其中，所述常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
其中，所述微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
其中，所述有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
本发明内容还包括一种胚状体增殖生长组合培养基，所述组合培养基包括所述的体细胞胚诱导培养基，还包括胚状体增殖和生长培养培养基。
其中，上述胚状体增殖和生长培养基为ms+0.5～1mg/lnaa+0.05～0.1mg/l6-ba+0.1～0.2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+0.7％琼脂。
本发明内容还包括一种无种质基因型限制高频体胚再生培养基，所述无种质基因型限制高频体胚再生培养基包括所述的体细胞胚诱导培养基，还包括所述的胚状体增殖和生长培养培养基、丛生芽的成苗快繁培养基和壮苗生根培养基。
其中，上述丛生芽的成苗快繁培养基为ms+1～2mg/l6-ba+0.02～0.05mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.7％琼脂。
本发明内容还包括上述的体细胞胚诱导培养基、所述的胚状体增殖生长组合培养基、和/或所述的无种质基因型限制高频体胚再生培养基在禾本科草的培养中的应用。
本发明内容还包括述的体细胞胚诱导培养基、所述的胚状体增殖生长组合培养基、和/或所述的无种质基因型限制高频体胚再生培养基在结缕草属培养中的应用。
有益效果：现对于现有技术，本发明具有以下优点：
1)体细胞生长发育阶段，通过适时添加合适的激素及适量的浓度，诱导体细胞进入体细胞胚胎发育途径，及胚状体分化形成的需要，本发明通过在改良ms培养基的基础上增加了植物生长调节剂2,4-d、naa、6-ba、蔗糖、琼脂等组分，有效地克服了结缕草高频体胚再生培养中不同品种及基因型障碍问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率；
2)本发明常量营养元素配方以ms配方为主，将ms配方中的硫酸亚铁和乙二胺四乙酸二钠配制的铁盐换成乙二胺四乙酸铁钠盐，不但省却铁盐母液配制的环节，也避免铁盐配制不当易产生沉淀失效，降低利用率的问题；
3)本发明的改良ms培养基中微量营养元素配方以sh配方为主，而铜和钴的浓度较其它配方明显提高，有利于体细胞胚的诱导，实验效果证明确实更易获得体细胞胚；
4)本发明通过选择合适外植体、及依据外植体关键发育阶段及时调整培养基配方和激素成分浓度、及相应培养条件等，使这些因素达到良好相互协同作用，有效地克服了结缕草培养中不同种(品种)及基因型限制问题及高频体胚再生问题，大幅度提高体细胞胚发生频率和再生植株频率。体胚快繁不但能实现再生种子，还保证了优良种群性状的一致性和稳定性，以及新种质的特异性；是种质保存、种苗脱毒快繁、种质改良的最有效途径。体胚再生除繁殖效率高，还在生长势、坪用性状方面明显优于同期种子建坪或营养体建坪。所以建立结缕草体细胞胚胎发生技术和快速成苗体系(组合培养基)，不仅开辟了结缕草产业化开发的新途径，而且对快速繁殖种子来源困难的结缕草，具有重要的理论意义和应用价值。
附图说明
图1体细胞胚的发生及胚状体生长发育过程；1为本发明所述的结缕草和青岛结缕草愈伤组织中某些体细胞转化成胚性细胞的示意图；2为本发明所述的结缕草体细胞胚胎发育过程中的球形胚和鱼雷胚的示意图；3为本发明所述的兰引ⅲ号结缕草和细叶结缕草体细胞胚胎发育过程中的球形胚和盾片胚及兰引ⅲ号结缕草愈伤组织上只具根毛的示意图；4为本发明所述的沟叶结缕草体细胞胚胎发育过程中的球形胚、鱼雷胚和盾片胚的示意图；5为本发明所述的华南半细叶结缕草结缕草体细胞胚胎发育过程中的球形胚和胚状体芽丛的示意图；6为本发明所述的结缕草体细胞胚不同发育时期及胚状体分化成丛生芽的示意图；
图2胚状体丛生芽(左图)及快繁培养(右图)；
图3丛生芽生长发育过程；1和2分别为本发明所述的兰引ⅲ号结缕草和沟叶结缕草胚状体丛生芽外植体胚性愈伤组织分化发育的示意图；3为本发明所述的结缕草胚性愈伤组织分化出幼芽芽丛的示意图；4为本发明所述的兰引ⅲ号结缕草胚性愈伤组织完全分化为丛生芽的示意图；
图48个不同种质基因型的丛生芽成苗快繁培养；图1～8依次是：zg、zd、zq、z1、z3、zh、zx、zz8个不同种质基因型的丛生芽的示意图；
图5壮苗生根培养；左图为本发明所述的结缕草丛生芽分化发育出幼根的示意图；右图为本发明所述的细叶结缕草和兰引ⅲ号结缕草丛生芽分化出具根茎叶完整植株的示意图；
图6再生植株移栽及不同种质基因型成活植株。左图为本发明所述的结缕草再生植株移栽炼苗的示意图；右图为本发明所述的8个不同种质基因型结缕草和一个扦插对照结缕草再生植株移栽成活并生长良好的示意图。
具体实施方式：
下面通过实施例来进一步阐述本发明。
实施例1：体细胞胚诱导培养基
体细胞胚诱导培养基：改良ms+2mg/l2，4-d+0.2mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+40g/l蔗糖+0.7％琼脂，ph值5.8。
该改良ms培养基包括常量营养元素、微量营养元素和有机试剂：
常量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
微量营养元素的组分和其对应的浓度如下：
有机试剂的组分和其对应的浓度如下：
实施例2体细胞胚诱导培养基
与实施例1基本相同，所不同在于，该体细胞胚诱导培养基，为改良ms+4mg/l2，4-d+0.2mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+40g/l蔗糖+0.7％琼脂，ph值5.8。
实施例3体细胞胚诱导培养基
与实施例1基本相同，所不同在于，该体细胞胚诱导培养基，为改良ms+2mg/l2，4-d+0.1mg/lnaa+0.05mg/l6-ba+50g/l蔗糖+0.6％琼脂，ph值6.0。
实施例4胚状体增殖生长组合培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例1的培养基组分相同；
胚状体增殖和生长培养基：ms+1mg/lnaa+0.05mg/l6-ba+0.2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实施例5----胚状体增殖生长组合培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例1基本相同，所不同在于，该胚状体增殖和生长培养基：ms+1mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+0.2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实施例6--胚状体增殖生长组合培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例2的培养基组分相同；
胚状体增殖和生长培养基：ms+1mg/lnaa+0.05mg/l6-ba+0.2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实施例7胚状体增殖生长组合培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例3基本相同，所不同在于，该胚状体增殖和生长培养基：ms+1mg/lnaa+0.1mg/l6-ba+0.2mg/l2,4-d+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实施例8获得完整植株组合培养基--无种质基因型限制高频体胚再生培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例4的培养基组分相同；
胚状体增殖和生长培养基：与实施例4的培养基组分相同；
丛生芽的成苗快繁培养基：ms+1mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
壮苗生根培养基：1/2ms+20g/l白糖+0.7％琼脂；
上述所有培养基高压灭菌后ph在5.8左右。
实施例9获得完整植株组合培养基-无种质基因型限制高频体胚再生培养基
所不同在于，叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例5的培养基组分相同；胚状体增殖和生长培养基：与实施例5的培养基组分相同；其它与实施例8基本相同；
实施例10获得完整植株组合培养基-无种质基因型限制高频体胚再生培养基
所不同在于，叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例6的培养基组分相同；胚状体增殖和生长培养基：与实施例6的培养基组分相同；其它与实施例8基本相同；
实施例11获得完整植株组合培养基-无种质基因型限制高频体胚再生培养基
叶芽原基体细胞胚诱导发生培养基：与实施例7的培养基组分相同；
胚状体增殖和生长培养基：与实施例7的培养基组分相同；其它与实施例8基本相同；
实施例12获得完整植株组合培养基-无种质基因型限制高频体胚再生培养基
与实施例8基本相同，所不同在于，该丛生芽的成苗快繁培养基：ms+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实施例13获得完整植株组合培养基-无种质基因型限制高频体胚再生培养基
与实施例9基本相同，所不同在于，该丛生芽的成苗快繁培养基：ms+2mg/l6-ba+0.05mg/lnaa+30g/l蔗糖+0.7％琼脂；
实验例：
1、选材及灭菌处理：
选材：以分别来源于辽宁、青岛半岛；江苏及长三角周边地区；及广东及周边地区的野生或育成的结缕草5个种8个种群的种质基因型为实验研究材料，包括结缕草(zoysiajaponicasteud.(z1))、中华结缕草(z.sinicahance(zz))、沟叶结缕草(z.matrella(l.)merr(zg))、大穗结缕草(z.macrostachyafranch.etsaw.(zd))、细叶结缕草(z.tenuifoliawilld.extrin.(zx))青岛结缕草(zoysiajaponicacv.qingdao(zq))、兰引ⅲ号结缕草(zoysiajaponicacv.lanyin3(z3))、华南半细叶结缕草(z.matrellacv.huanan(zh))等，分别用符号z1、zz、zg、zd、zx、zq、z3、zh表示。
灭菌处理：切取生长期的结缕草半嫩茎带2～4节匍匐茎段，先用加洗洁精水冲洗10分钟左右，再用3％次氯酸钠液消毒15分钟，在无菌室用75％酒精消毒20～30秒，无菌水冲洗3～5次，0.1％升汞消毒6～8分钟，无菌水冲洗5～8次，灭菌吸水纸吸干水分，剪取含2～3个节外植体接种到无菌芽苗培养基上进行无菌芽苗的萌动生长驯化培养，1000～1500lx光照下16h/d，培养26～28d。培养温度为白天室温28士2℃，夜晚20±2℃(培养温度若没有特别说明后面步骤一样)，以下类同。
该无菌芽苗培养基：1/4ms+ga30.1mg/l+6-ba0.2mg/l+20g/l白糖+0.7％琼脂。
2、叶芽原基体胚诱导发生培养：
选取无菌芽苗茎节处开始萌动的叶芽原基作为外植体，切取0.5cm大小的无菌叶芽原基转接到实施例1～3制备的体细胞胚诱导培养基即上暗培养28±2d。以上3种实施例以实施例1为最佳，8个不同种质基因型结缕草体细胞胚诱导率最低为49.9％，最高85.3％，平均达到70.3％；而实施例2最低为35.2％，最高61.7％，平均为51.5％，较实施例1次之；实施例3最低为29.7％，最高为52.4％，平均为45.9％，可以看出实施例3最差。
3、胚状体增殖和生长培养：
将上述步骤2培养得到的材料转接到胚状体增殖和生长培养基上，先放入6±2℃人工气候培养箱低温暗培养6～8d，再转入600～800lx16h/d弱光照下培养26～28d，培养温度同前，统计胚状体形成率。其结果参见表1。
4、丛生芽的成苗快繁培养：
将上述步骤3得到的胚状体丛生芽切割成0.5cm大小的外植体转接于丛生芽分化成苗快繁培养基上，2000～2500lx16h/d光照强度下培养28～30d统计丛生芽分化率；
5、壮苗生根培养：
将上述步骤4得到的丛生芽苗转接于壮苗生根培养基上，2000～2500lx16h/d光照强度下培养26～30d形成生根的再生植株，。统计再生植株的生根率，通过本方法生根率达到100％。(图5：1-2)
6、再生植株移栽及成活；
将生根的再生植株移栽到温室小花盆中，盆土组分及重量百分比为：蛭石：泥炭土：园土＝2：4：4混合；将小花盆放到遮荫处，移栽初期每天浇水1～2次，待苗成活后逐渐减少浇水次数，15～20d后统计成活率。通过本方法移栽成活率达到100％。(图6：1-2)
将本实验例中的5个种8个种群每个种群600个外植体(每个重复3次)分别采用实施例4～9中的培养基组合上进行体细胞胚胎发生诱导培养、胚状体增殖和生长培养、丛生芽的成苗快繁培养、壮苗生根培养及再生植株移栽成活。
通过实验结果比较，实施例4培养基组合为最佳实施例，实施例6培养基组合为次好实施例。
本实验例的实验结果如下：
通过显微观察(图1：1-6)可以清晰看到体胚的发生及胚状体生长发育过程：结缕草外植体初期首先形成愈伤组织，随培养时间延长，在愈伤组织中某些体细胞分化成胚性细胞，表现为细胞质浓厚，细胞快速分裂生长并形成一些突起，与周围细胞组织有明显的界限，进而可见球形胚、鱼雷胚或盾片胚等的形成，及至整个愈伤组织完全发育成胚状体丛生芽(图2：1)；把胚状体丛生芽转入丛生芽分化成苗快繁培养基上培养(图2：2)，就可以获得大量的丛生芽(图3：1-4)；上述6种组合的实施例中都能获得胚状体和丛生芽，但频率有所不同，胚状体形成率效果最好的组合是实施例4，其次是实施例5(表1)；
表1不同实施例对8结缕草种群胚状体形成率影响比较
表2不同实施例对8结缕草种群丛生芽分化率影响比较
注：结缕草(z1)、中华结缕草(zz)、沟叶结缕草(zg)、大穗结缕草(zd)
、细叶结缕草(zx)青岛结缕草(zq)、兰引ⅲ号结缕草(z3)
、华南半细叶结缕草(zh)
丛生芽分化率效果最好的组合是实施例8和实施例12，其次是实施例9和
实施例13(表2)，和胚状体形成率结果一致，但仔细观察发现：实施例12、实施例13尽管丛生芽分化率和实施例8、实施例9一样，但丛生芽苗有些玻璃化现象，所以丛生芽分化率效果最好的组合还是实施例8，其次是实施例9；
8个不同种质基因型的胚状体丛生芽转入丛生芽分化成苗快繁培养基上培养，均可获得大量的丛生芽，效果最好的均是实施例8(图4：1-8)；通过表2和图4可以说明：只要有胚状体形成，丛生芽分化再生就很容易。从而也说明体胚的诱导及胚状体的分化形成是该项发明技术的关键核心。
由此可以得出：通过选择合适的外植体、外植体不同发育时期选择合适的培养基及成分、调整不同的培养基组合，调整培养条件等各个环节，使这些因素适时配合使用，通过它们之间的相互协同作用，最大程度地发挥其互补效应，从而有效地解决了结缕草种质基因型限制的问题，极大地提高了其胚状体形成率和丛生芽分化率，获得完整再生植株的效果。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。