适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法
【专利摘要】本发明公开了适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法，所述方法包括前处理、愈伤组织的诱导、体细胞胚的诱导、完整植株的形成、炼苗和移栽步骤。在前处理过程中，所用植物生长调节剂为浓度为0.01-0.1mg/L的TDZ；在愈伤组织的诱导和体细胞胚的诱导过程中，所用生长调节剂为6-BA和IAA，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0.01-0.5mg/L。本发明不仅适用于多基因型的西瓜体细胞诱导，还具有愈伤组织诱导率高、体细胞胚诱导率高、每外植体的体细胞胚数目多、实施步骤简单，实施条件不苛刻的优点。
【专利说明】适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物【技术领域】，特别涉及适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及 植株再生方法。
【背景技术】
[0002] 西瓜是一种重要的蔬菜作物，在世界10大果品中居第5位，作为一种高产值的经 济作物在世界各地被广泛种植。随着人民生活水平的提高，人们对西瓜种类和品质的要求 越来越高，西瓜的育种目标也趋向于多元化的发展。但是传统的遗传育种存在种质资源匮 乏，育种周期太长，后代表现出的遗传性状不稳定等不足；而通过离体培养、遗传转化等生 物技术获得高产优质的品种已成为重要的植物育种手段之一。
[0003] 离体培养下没有经过受精过程，但经过胚胎发生和胚胎发育过程所形成的类胚结 构称为体细胞胚。体细胞胚不仅可为研究细胞分化、细胞全能性机理和人工种子提高理想 实验体系和技术基础，还具有可长期保存、遗传稳定性商、再生频率商的优点，同时还利于 突变体的选择，还可作为制备原生质体的材料。具体的，经体细胞胚途径再生植株对于西瓜 的快速繁殖、种质资源的保存、优良性状的培育以及基因工程受体系统的优化等都具有十 分重要的理论意义和应用价值。
[0004] 然而，现有技术中关于西瓜体细胞胚诱导及植株再生的成功报道却很少，且不同 西瓜品种的组培条件差异极为显著，成功的报道可重复性很低，且只能针对一到两个基因 型。1993年Compton和Gray用西瓜幼胚子叶为外植体成功诱导了体细胞胚再生，诱导率最 高只有7%左右，且不同基因型之间的差异很大，之后牛姗姗（2006)和宋尚伟等（2007)以 西瓜幼苗子叶为外植体，报道了最高25%和27. 5%的体细胞胚诱导率，而诱导所得体细胞胚 的质量和每外植体体细胞胚发生数量也均较低或者无据可查。在组织培养过程中，尤其重 要的是培养基的选择及其激素的添加，这对于无菌苗的质量、愈伤组织的诱导及体细胞胚 的发生具有重要的影响，是决定外植体体细胞胚发生和植株再生的关键环节。然而，不同培 养基及激素在不同基因型上的表现具有很大差异性，现有技术仍未找到一种适用于多基因 型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法。
[0005] 因此，建立一个适用于多基因型的西瓜高频体细胞胚发生及植株再生方法，具有 重大意义，可为西瓜的优良育种及转基因研究等其它相关方面研究提供良好的受体再生系 统。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供一种适用于多基因型的西瓜高频体 细胞胚发生及植株再生方法。该方法包括以下步骤： 1)前处理：将西瓜种子剥去种皮后进行灭菌，再将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行 培养，每瓶接种8粒，接种后先置于黑暗条件下培养3 d，培养温度为23_27°C，再转移到光 照时间为16 h/d的条件培养3 d，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为 0- 0. I mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6. O g/L的琼脂，pH值调至6 ; 2) 愈伤组织的诱导：切取子叶外植体，放入含6-BA和IAA的1/2 MS培养基中，先置于 黑暗条件下培养7 d，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养14 d，培养温度为23-27°C， 光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0. 01-0. 5mg/L，培养基中添加 30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 3) 体细胞胚的诱导：将步骤2)所得愈伤组织放入含6-BA和IAA的1/2 MS培养基中， 在光照时间为16 h/d的条件培养28 d获得体细胞胚，培养温度为23-27°C，光照强度为 3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0. 01-0. 5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗 糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 4) 完整植株的形成：将步骤3)所得的体细胞胚放入无激素的装有1/2 MS培养基的培 养瓶中进行培养，培养时间为28 d，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为 16 h/d，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 5) 炼苗：选取经步骤4)培养后的具有3个以上叶片和5-6 cm强直根的健壮小苗，将 培养瓶的盖子先拧松放置2 d，再半开2 d，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断 补充水分； 6) 移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、 草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27°C下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养， 1- 2周后再移到室外进行培养。
[0007] 所述的灭菌过程为：剥去西瓜种子的种皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用 0. 1%升萊浸泡消毒5min,最后用无菌水冲洗5次。
[0008] 所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
[0009] 优选的，步骤1)中的TDZ浓度为0. 01mg/L。当TDZ的浓度为0. 01mg/L时，可以获 得最理想的体细胞胚诱导率和每外植体所产生的体细胞胚数。
[0010] 优选的，步骤2)和步骤3)中的6-BA的浓度为3mg/L，IAA的浓度为0. 05mg/L。当 IAA的浓度为0. 05mg/L时，体细胞胚诱导率和每外植体上体细胞胚数量达到最优。
[0011] 本发明具有如下有益效果： 1、 适用于多基因型的西瓜体细胞胚诱导； 2、 愈伤组织诱导率高、体细胞胚诱导率高、每外植体的体细胞胚数目多； 3、 实施步骤简单，实施条件不苛刻。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1 :西瓜子叶上诱导出的愈伤组织； 图2 :愈伤组织上产生的体细胞胚； 图3 :体细胞胚出芽； 图4 :体细胞胚生根； 图5 :再生苗； 图6 :移栽苗。
【具体实施方式】
[0013] 下面通过实施例对本发明进行具体描述，有必要在此指出的是以下实施例只是用 于对本发明进行进一步的说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的技术熟练 人员根据上述
【发明内容】
所做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
[0014] 实施例1 选取大小均匀、饱满的西瓜种子，在超净工作台上剥去种皮，先用75%的酒精浸泡消毒 lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒6min，然后用无菌水冲洗5次，然后置于培养皿内的无菌滤纸 上，用消毒后的镊子将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培养，每瓶接种8粒。接种后先 置于黑暗条件下培养3 d，再转移到16 h/d光周期条件培养3 d，培养温度为23-27°C，光照 强度为3000 lx，TDZ的浓度为0-0.1 mg/L，培养基中添加蔗糖30 g/L，琼脂6.0 g/L，pH值 调至6。诱导时，设三组实验组，第一组中6-BA的浓度为2. Omg/，IAA的浓度为0. 01mg/L ; 第二组中6-BA的浓度为4. Omg/L，IAA的浓度为0. 5mg/L ;第三组中6-BA的浓度为3. Omg/ L，IAA的浓度为0. lmg/L ;实验结果取三组实验结果平均值。
[0015] TDZ前处理对愈伤组织及体细胞胚诱导的影响见表1。
【权利要求】
1. 适用于多基因型的西瓜体细胞胚高效诱导及植株再生方法，其特征在于：包括以下 步骤： 前处理：将西瓜种子剥去种皮后进行灭菌，再将种胚接种在含TDZ的MS培养基进行培 养，每瓶接种8粒，接种后先置于黑暗条件下培养3 d，培养温度为23-27°C，再转移到光照 时间为16 h/d的条件培养3 d，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，TDZ的浓度为 0- 0? I mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 愈伤组织的诱导：切取子叶外植体，放入含6-BA和IAA的1/2 MS培养基中，先置于黑 暗条件下培养7 d，再转移到光照时间为16 h/d的条件培养14 d，培养温度为23-27°C，光 照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0. 01-0. 5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 体细胞胚的诱导：将步骤2)所得愈伤组织放入含6-BA和IAA的1/2 MS培养基中，在 光照时间为16 h/d的条件培养28 d获得体细胞胚，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，6-BA的浓度为2-4mg/L，IAA的浓度为0. 01-0. 5mg/L，培养基中添加30 g/L的蔗糖和 6.0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 完整植株的形成：将步骤3)所得的体细胞胚放入装有不含激素的1/2 MS培养基的培 养瓶中进行培养，培养时间为28 d，培养温度为23-27°C，光照强度为3000 lx，光照时间为 16 h/d，培养基中添加30 g/L的蔗糖和6. 0 g/L的琼脂，pH值调至6 ; 5) 炼苗：选取经步骤4)培养后的具有3个以上叶片和5-6 cm强直根的健壮小苗，将 培养瓶的盖子先拧松放置2 d，再半开2 d，然后再全开2 d，半开和全开盖子期间需要不断 补充水分； 6) 移栽：将炼苗完成后的植株拔起，用水洗净根部培养基，移栽到装有泥炭土、珍珠岩、 草木灰和腐叶土基质的营养钵中，在23-27°C下，套上保鲜袋置于人工气候箱中保湿培养， 1- 2周后再移到室外进行培养。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1)所述的灭菌过程为：剥去西瓜种 子的种皮，先用75%的酒精浸泡消毒lmin，再用0. 1%升汞浸泡消毒5min，最后用无菌水冲 洗5次。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤6)所述营养钵中泥炭土、珍珠岩、草 木灰和腐叶土基质的质量比为1:1:1:1。
【文档编号】A01H4/00GK104304032SQ201410621737
【公开日】2015年1月28日 申请日期:2014年11月7日 优先权日:2014年11月7日
【发明者】李焕秀, 唐懿, 孙国超, 汪志辉, 涂利华, 赖云松, 夏惠, 王迅, 吕秀兰, 黄志 , 姜建业, 谢永东, 余雪娜 申请人:四川农业大学