本发明涉及一种青天葵球茎组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
青天葵为兰科植物毛唇芋兰nerviliafordii(hance)schitr的叶或带球茎的叶，又名独叶莲、独脚莲、珍珠叶、坠千斤、铁帽子、山米子、青莲。性平，味苦，甘、凉。青天葵是我国珍稀濒危植物，有清肺止咳，健脾消积，清热解毒，消结散疬等功效，主治肺痨咯血，肺热咳嗽，小儿肺炎，急性喉炎，口腔炎，咽喉肿痛，瘰疬，疮疡肿毒，跌打损伤等。青天葵主要以球茎进行繁殖，但繁殖系数极低，加之多年来人们灭绝式的挖掘，导致野生青天葵资源日益枯竭。然而，国内外市场的需求量却逐年加大，青天葵已远远满足不了市场的需求。
通过栽培试验比较，发现青天葵组培球茎不仅能正常生长，而且在相同条件下栽培组培球茎优于野生球茎。因此，如何利用现代生物技术通过优化青天葵组织培养条件，为青天葵组织培养规模化生产育苗提供技术支撑，从而更好的开发和利用青天葵药用植物资源。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种青天葵球茎组织培养快速繁殖方法。
本发明为实现上述目的，采取以下技术方案予以实现：
一种青天葵球茎组织培养快速繁殖方法，包括以下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：青天葵球茎作为外植体进行消毒，首先将3-5滴洗洁精滴入装有50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌5min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗20-30min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒1-2min、无菌水冲洗3-5次，获得无菌外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌根状茎的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导，发芽得到无菌根状茎，所述诱导培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂，20g·l-1蔗糖，1.5mg·l-1的6-苄基腺嘌呤，0.3mg·l-1的萘乙酸，培养基ph值为6.8，培养条件为：温度为25-27℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d，培养时间为15-20d；
(3)根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养：切取2-3cm的无菌根状茎置于添加5g·l-1琼脂，25g·l-1蔗糖，1.0-2.0mg·l-1的6-苄基腺嘌呤、0.1-0.5mg·l-1的激动素(kt)、0.1-0.5mg·l-1的萘乙酸、桔子汁100-200g·l-1的1/2ms培养基中培养获得球茎，培养基ph值为6.8，培养条件为：温度为25-27℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为13-14/d，培养时间为20d；
(4)球茎炼苗移栽：球茎进行炼苗后移植于基质中培养，先移栽至大棚7天，再移栽至大田。
优选的，步骤(4)中的炼苗移栽按以下操作进行：经过步骤(3)获得球茎，在室温为20℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出球茎，洗净培养基，再放入abt生根粉配成100mg/·l-1的溶液中浸泡30min,浸泡后移栽到基质中生长30-40d，再移栽至大田。
优选的，所述基质为按优质塘泥：黄沙＝2：1的比例混合。
与现有技术相比，本发明技术方案的有益效果是：
(1)本发明通过生物技术对青天葵球茎进行组织培养快速繁殖，在短时间内培育出大量可供大田栽培的青天葵种苗，显著提高了青天葵种苗的繁殖系数和种苗质量，实现规模化生产，满足生产上的需要。
(2)通过根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养进行青天葵球茎的繁殖，缩短了培养时间，减少培养步骤，降低了培养成本，提高了青天葵种苗的生产效率。
(3)根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养20天后，球茎诱导系数达到20.2～25.3，移栽基质后成活率在90～95％，有效解决了青天葵的规模化育苗问题。
具体实施方式
以下结合具体实施例来对本发明作进一步的说明。
实施例1
本发明所述的青天葵球茎组织培养快速繁殖方法的一个实例，包括如下步骤：
(1)外植体的取材与消毒：青天葵球茎作为外植体进行消毒，首先将3-5滴洗洁精滴入装有50ml自来水的烧杯中，把外植体放入烧杯轻轻搅拌5min，再用棉花清洗外植体表面污垢，自来水轻微流水冲洗20-30min；移置超净工作台，用75v/v％乙醇浸泡30s，无菌水冲洗一遍，然后再用添加了1-2滴吐温-20的50ml浓度为0.1v/v％升汞消毒1-2min、无菌水冲洗3-5次，获得无菌外植体，其中无菌水为经高高温压灭菌的蒸馏水；
(2)无菌根状茎的获取：将消毒好的外植体置于诱导培养基中进行不定芽诱导，在温度为25-27℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为10-12h/d的条件下培养15-20d，得到无菌根状茎。
(3)根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养：切取2-3cm的无菌根状茎置于根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养基中，在温度为25-27℃，光照强度1500-2000lux，光照时间为13-14h/d的条件下培养时间为20d，球茎诱导系数为23.2。
(4)球茎炼苗移栽：经过步骤(3)获得球茎，在室温为20℃的室内进行炼苗，并在瓶中加水淹没培养基，炼苗5-7d，取出球茎，洗净培养基，再放入abt生根粉配成100mg/·l-1的溶液中浸泡30min,浸泡后移栽到基质中生长30-40d，先移栽至大棚7天，再移栽至大田。成活率为91.3％所述基质为按优质塘泥：黄沙＝2：1的比例混合。
其中，各阶段使用的培养基配方如下：
所述诱导培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂，20g·l-1蔗糖，1.5mg·l-1的6-苄基腺嘌呤，0.3mg·l-1的萘乙酸，培养基ph值为6.8。
所述根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂，25g·l-1蔗糖，1.0mg·l-1的6-苄基腺嘌呤、0.1mg·l-1的激动素(kt)、0.1mg·l-1的萘乙酸、桔子汁100g·l-1，培养基ph值为6.8。
实施例2
本发明所述的青天葵球茎组织培养快速繁殖方法的另一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂、25g·l-1蔗糖、1.5mg·l-1的6-苄基腺嘌呤、0.3mg·l-1的激动素(kt)、0.3mg·l-1的萘乙酸、桔子汁100g·l-1，培养基ph值为6.8；球茎诱导系数为22。
步骤(4)中，移栽成活率率为94％。
实施例3
本发明所述的青天葵球茎组织培养快速繁殖方法的再一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂、25g·l-1蔗糖、1.5mg·l-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·l-1的激动素(kt)、0.5mg·l-1的萘乙酸、桔子汁150g·l-1，培养基ph值为6.8；球茎诱导系数为24.4。
步骤(4)中，移栽成活率率为91.5％。
实施例4
本发明所述的青天葵球茎组织培养快速繁殖方法的又一个实例，包括如下步骤：
其他条件同实施例1，仅以下内容不同：
步骤(3)中，根状茎繁殖及球茎诱导一体化培养基是以1/2ms为基本培养基，添加5g·l-1琼脂、25g·l-1蔗糖、2.0mg·l-1的6-苄基腺嘌呤、0.5mg·l-1的激动素(kt)、0.5mg·l-1的萘乙酸、桔子汁200g·l-1，培养基ph值为6.8；球茎诱导系数为23.8。
步骤(4)中，移栽成活率率为94.8％。
本发明未涉及部分均与现有技术相同或可采用现有技术加以实现。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内限制本发明之权利范围。