本发明涉及通过组织培养技术的植物再生，进一步而言，涉及栝楼嫩叶的组培育苗方法。
背景技术：
栝楼（trichosantheskirilowii）为葫芦科栝楼属多年生攀援藤本植物，产辽宁、华北、华东、中南、西北、四川、贵州和云南。其根（天花粉）、果实（瓜蒌）、果皮（瓜蒌皮）、种子（瓜蒌仁）均是常用中药材，用于治疗多种疾病。此外，其果实可美容、观赏，种子、根可食用，全株可用于绿化。由于经济价值很高，近年来其种植范围越来越广、种植面积逐步扩大。栝楼为雌雄异株，开花前无明显的形态差异，难以分辩，而种子繁殖的幼苗，雌雄比例约为3：7，而栝楼栽培雌雄植株的合理配比为10∶1，种子苗栽培利用直接影响产量和经济效益。分根繁殖虽然能分辨雌雄株，但繁殖系数低，且种苗容易退化，使发展良种生产受到一定限制。只有通过组织培养技术，才能实现栝楼种苗雌雄株定向培养，解决雌雄株合理配比的问题。目前栝楼组织培养技术研究报道较多，主要存在幼嫩外植体杀菌不彻底，伤口容易褐变，移栽成活率低等问题，导致工厂化组培育苗困难，无法满足规模化生产种苗的需要。
以栝楼顶芽、腋芽、带芽茎段、叶片、块茎幼苗的茎尖和卷须等为外植体选择的研究均有报道，大部分研究表明，带芽茎段是较好的外植体。由于栝楼嫩芽带有绒毛，如果杀菌时间较短，则容易污染，杀菌时间过长，则外植体剪口容易氧化褐变，外植体消毒不彻底导致初诱导不成功是当前栝楼组培育苗技术急需攻克的技术难点之一。大部分研究均采用75%乙醇联合0.1%升汞的植物组织培养常用消毒方法，污染率在5.0%～42.8%；采用5.2%次氯酸钠替代0.1%升汞后，污染率为31.4%；选用75%乙醇联合0.31%升汞进行外植体消毒，污染率为31%～41%。中国专利申请件cn105191800a《一种栝楼脱毒组培快繁的方法》对腋芽采用42℃热水处理65min后获得脱毒材料，经脱毒炼苗和组织培养后获得脱毒苗，但未对污染率和诱导成活率做具体报道。余慧琳等（2009）将栝楼茎段洗净，切成2cm左右小段，放入高锰酸钾500倍液浸泡40min后，放入新洁尔灭500倍液浸泡30min，再用75%酒精与0.1%升汞或体积比为1∶25的次氯酸钾溶液消毒处理，发现可以减缓外植体的褐化。佟宏霞等（1996）发现，在栝楼初诱导培养基中添加水解酪蛋白有利于外植体抗褐化，添加ga会加速外植体褐化。
栝楼外植体初诱导培养、愈伤组织诱导和丛生芽继代增殖培养最佳培养基均为ms培养基。不同培养阶段的激素种类组合和浓度配比有较大差异。栝楼初诱导细胞分裂素多选用6-ba（6-卞氨基嘌呤），添加浓度在0.1～5.0mg.l-1；生长素有添加0.05～0.5mg.l-1naa（萘乙酸），也有添加0.06～0.5mg.l-1iba（吲哚丁酸），少数研究添加0.6mg.l-1iaa（吲哚乙酸）；个别研究直接添加1.0mg.l-1以上的6-ba诱导外植体产生不定芽。研究表明，栝楼组培苗叶片容易诱导分化愈伤组织，细胞分裂素6-ba最适浓度为0.5mg.l-1或4.0mg.l-1，生长素naa浓度为0.2～1.0mg.l-1，生长素iaa浓度为0.2mg.l-1；少量研究报道茎切段、叶片切块及子叶切块在ms＋1.0mg.l-12,4-d（2，4-二氯苯氧乙酸）＋0.5mg.l-16-ba上能形成愈伤组织，但以茎切段形成愈伤组织的速度最快、质量最好。栝楼愈伤组织诱导丛生芽分化或继代增殖培养的激素处理方法有较大差异，大部分研究认为0.1～4.0mg.l-16-ba与0.02～0.4mg.l-1naa组合较好，少部分研究认为0.15～1.0mg.l-16-ba与0.1～0.3mg.l-1iba、或0.1mg.l-16-ba与0.6mg.l-1iaa组合后有利于丛生芽诱导分化；一些研究只在ms培养基中添加1.5～7.0mg.l-16-ba诱导丛生芽，有报道在ms培养基中添加500mg.l-1水解酪蛋白后，更有利于丛生芽诱导分化。栝楼不定芽诱导生根方法也有较大差异，大部分研究认为ms培养基较1/2ms培养基有利于生根培养；大部分研究在培养基中添加0～1.0mg.l-1生长素naa或0.3～0.5mg.l-1生长素iba均能诱导生根；少量研究认为用0.1～1.0mg.l-1生长素naa与0.1～0.5mg.l-1生长素iba组合后有利于生根；iba更有利于根系的分化。
陈惠等（1996）较早报道了栝楼组培苗炼苗方法及影响因子，认为移栽环境空气湿度低是造成组培苗移栽萎蔫死亡的主要原因;cn105191797a对比文件中采用湿度80%以上，温度20～30℃的盘苗炼苗2～3月后，再移栽定植到苗床的方式移栽组培苗；大部分研究认为沙土混合移栽基质能有效提高组培苗移栽成活率，生成的栝楼组培苗整齐健壮，生长活性强，移栽成活率可达77.1%；以体积比1:3的蛭石和珍珠岩混合基质苗床移栽成活率可达85％以上；以泥炭和松林下腐殖土混合基质移栽成活率可达90%以上。
中国专利数据库中涉及栝楼组培方法的专利申请件还有：2009101726560号《一种栝楼组培快繁的方法》、zl2013104591627号《一种提高栝楼组培苗移栽成活率的方法》、zl2014108145780号《一种生产栝楼组培苗的方法》等。这些技术方案都能够提高栝楼组培，但还存在外植体褐变、成活率不理想的缺点。
技术实现要素：
本发明旨在提供一种能显著降低栝楼外植体褐变、降低污染率、提高瓶苗移栽成活率和减少管护成本的栝楼嫩叶组培育苗方法，为栝楼良种工厂化育苗提供技术支撑。
发明人提供的栝楼嫩叶的组培育苗方法，包含以下步骤：
（1）外植体消毒：采集刚萌发5～10天的栝楼带叶柄嫩叶做外植体；冲洗干净后，用3000mg.l-1维生素c蒸馏水溶液浸泡40min，然后用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，用蒸馏水冲洗3～5次，再用1000mg.l-1氯化汞水溶液常规消毒10min，蒸馏水冲洗5次。
（2）组织培养条件的设定：各阶段的基本培养基均为：1/2ms+12g.l-1琼脂+30g.l-1蔗糖，ph值6.0；培养条件为：温度24～26℃，光照为1500～2000lux，光照时间为12～14hr/d。
（3）愈伤组织诱导培养：将消毒后外植体的叶柄插入培养基中，叶片部分出露，诱导叶片分化愈伤组织。培养30天后，可产生直径1.5cm的绿色疏松愈伤组织；培养基配方：基本培养基+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+1.0mg.l-1tdz+0.1mg.l-12,4-d+0.5mg.l-1naa。
（4）丛生芽诱导培养：将初诱导培养产生的愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种到丛生芽诱导培养基上。培养35天后，每块可分化5～8个丛生芽。最佳配方：基本培养基+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.1mg.l-1tdz+0.2mg.l-1naa。
（5）丛生芽继代增殖培养：将高度1.0cm以下丛生芽分割成带愈伤组织小块的单株后接种到继代增殖培养基上，培养20天后，可产生5个以上丛生芽；最佳配方：基本培养基+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.5mg.l-1naa。
（6）生根诱导培养：将继代增殖形成的丛生芽分割成单株后接种到生根培养基上，培养20天后开始产生根系；最佳配方：基本培养基+500mg.l-1花宝1号+1.0g.l-1ac+1.2mg.l-1iba+0.1mg.l-16-ba。
（7）瓶苗移栽：将瓶苗进行炼苗培养；同时将基质处理后装入营养袋中；将炼苗后的瓶苗取出，洗净根系后置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；将植苗营养袋挨个放入泥底苗床中，然后浇透水，搭棚遮阴，完成幼苗移栽。
上述方法的第（7）步中，所述炼苗培养技术是：将生根培养30天，苗高5～8cm，根系5～10根瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入15ml蒸馏水，带瓶移入遮荫率70%的大棚，在环境温度20～30℃的条件下炼苗培养10d。
上述方法的第（7）步中，所述幼苗移栽包括以下技术：①基质处理：将蛭石+砂质黄壤混合基质（体积比为1:2）用3000mg.l-1的多菌灵水溶液消毒处理后装入5cm×8cm的营养袋中；②将炼苗后的瓶苗取出，用水清洗净根系，置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；③将植苗营养袋挨个放入宽度1m，深度0.2cm的泥底苗床中，然后浇透水；在苗床上搭0.5m高小拱棚遮阴，上覆白色地膜和遮阴率50%遮阳网。
发明人指出方法的第（1）步中，带叶柄嫩叶外植体用3000mg/l抗氧化剂维生素c蒸馏水溶液浸泡40min；用2500mg/l高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，不用75%乙醇消毒，污染率可降低到5%以下，可显著提高外植体活力。
发明人还指出：方法的第（7）步中瓶苗移栽后浇透水，然后在苗床上搭0.5m高小拱棚，上覆白色地膜和遮阴率50%遮阳网，可以连续1个月不用浇水，能保持苗床周围空气湿度达90%以上，温度在25～30℃，移栽成活率可达90%以上。
本发明的创新点：本发明提供的栝楼嫩叶的组培育苗方法，解决了栝楼外植体因带绒毛不容易杀菌易污染、消毒时间过长容易褐化、瓶苗移栽容易萎蔫死亡等技术瓶颈。本方法选用较带芽茎段材料容易获得的带叶柄嫩叶为外植体，通过用3000mg.l-1抗氧化剂vc蒸馏水溶液浸泡40min，可以显著提高外植体抗氧化、褐变的能力，然后用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，不用75%乙醇消毒，污染率可低到5%以下，可显著提高外植体活力。通过在瓶苗定植苗床上搭0.5m高小拱棚，上覆白色地膜和50%遮阳网的方式，在连续1个月不浇水的情况下，能保持苗床周围空气湿度达90%以上，温度在25～30℃，移栽成活率可达90%以上，降低管理成本。本方法首次用细胞分裂素tdz、2,4-d与生长素naa组合后直接诱导叶片分化愈伤组织，增殖系数可达5以上，较已有报道减少了先诱导带芽茎段分化不定芽，再用不定芽叶片诱导愈伤组织继代增殖的环节，提高组培育苗的效率。发明人还通过在每个阶段的基本培养基中均添加1.0g.l-1活性炭来吸附有害物质，添加1.0g.l-1聚乙烯吡咯烷酮来抑制和分解外植体培养过程中分泌产生的酚类等有害物质的方式，从而达到提高外植体分化率，降低褐变率的效果。本方法各个阶段的激素配方均通过试验统计获得，可为栝楼良种工厂化种苗繁育利用提供技术支撑。
具体实施方式
实施例1：2015年4月的试验
（1）外植体消毒处理：2015年4月，采集刚萌发5天的栝楼带叶柄嫩叶50片，自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗2遍。用3000mg.l-1维生素c蒸馏水溶液浸泡40min，蒸馏水冲洗3遍。在超净工作台上，用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，用蒸馏水冲洗3次；然后用将外植体剪成带1cm长叶柄，叶面积1cm2，用1000mg.l-1氯化汞水溶液常规消毒10min，用蒸馏水冲洗5次。
（2）愈伤组织诱导培养：将消毒后外植体的叶柄插入培养基中，叶片部分出露，诱导叶片分化愈伤组织。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+1.0mg.l-1tdz+0.1mg.l-12,4-d+0.5mg.l-1naa，ph值6.0。共接种50片。接种10天后，2片褐变死亡，其余叶片边缘卷曲膨大，无污染；接种30天后，48片叶全部分化产生绿色疏松愈伤组织，直径1.5cm以上。
（3）丛生芽诱导培养：将初诱导培养产生的愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种到丛生芽诱导培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.1mg.l-1tdz+0.2mg.l-1naa，ph值6.0。共接种300块，培养20天后，愈伤组织分化绿色芽点，35天后，平均每块分化5.9个丛生芽。
（4）丛生芽继代增殖培养：将高度1.0cm以下丛生芽分割成带愈伤组织小块的单株后接种到继代增殖培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.5mg.l-1naa，ph值6.0。共接种1500块，培养20天后，平均每块分化5.3个丛生芽。
（5）生根诱导培养：将继代增殖形成的丛生芽分割成单株后接种到生根培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+500mg.l-1花宝1号+1.0g.l-1ac+1.2mg.l-1iba+0.1mg.l-16-ba，ph值6.0。共接种7500个单芽，培养20天后开始产生根系，30天后全部生根，每株产生根系5根以上。
（6）各阶段培养条件为：温度24～26℃，光照为1500～2000lux，光照时间为12～14hr/d。
（7）瓶苗移栽：2015年8月下旬，将苗高8cm、根系5根以上瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入15ml蒸馏水，带瓶移入遮荫率70%的大棚，在自然变温条件下炼苗培养10d；同时将蛭石+砂质黄壤混合基质（体积比为1:2）用3000mg.l-1的多菌灵水溶液消毒处理后装入5cm×8cm的营养袋中；将炼苗后的瓶苗取出，用水清洗净根系，置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；将植苗营养袋挨个放入宽度1m，深度0.2cm的泥底苗床中，然后浇透水；在苗床上搭0.5m高小拱棚，上覆白色地膜和50%遮阳网。共移栽定植7500株，2015年10月上旬检查，成活率95.0%；先揭开小拱棚两端炼苗10天，然后全部撤掉小拱棚越冬，2016年3月下旬，新芽萌发后再露天定植，成活率90.0%以上。
实施例22016年4月的试验
（1）外植体消毒处理：2016年4月，采集刚萌发10天的栝楼带叶柄嫩叶50片，自来水冲洗干净后，蒸馏水冲洗3遍。用3000mg.l-1维生素c蒸馏水溶液浸泡40min，蒸馏水冲洗3遍。在超净工作台上，用2500mg.l-1高锰酸钾蒸馏水溶液浸泡30min，用蒸馏水冲洗5次；然后用将外植体剪成带1cm长叶柄，叶面积1cm2，用1000mg.l-1氯化汞水溶液常规消毒10min，用蒸馏水冲洗5次。
（2）愈伤组织诱导培养：将消毒后外植体的叶柄插入培养基中，叶片部分出露，诱导叶片分化愈伤组织。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+1.0mg.l-1tdz+0.1mg.l-12,4-d+0.5mg.l-1naa，ph值6.0。共接种50片。接种10天后，3片褐变死亡，其余叶片边缘卷曲膨大，无污染；接种32天后，47片叶全部分化产生绿色疏松愈伤组织，直径1.5cm以上。
（3）丛生芽诱导培养：将初诱导培养产生的愈伤组织分成直径0.5cm的小块后接种到丛生芽诱导培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.1mg.l-1tdz+0.2mg.l-1naa，ph值6.0。共接种300块，培养20天后，愈伤组织分化绿色芽点，35天后，平均每块分化5.2个丛生芽。
（4）丛生芽继代增殖培养：将高度1.0cm以下丛生芽分割成带愈伤组织小块的单株后接种到继代增殖培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+1.0g.l-1ac+1.0g.l-1pvp+2.0mg.l-16-ba+0.5mg.l-1naa，ph值6.0。共接种1500块，培养20天后，平均每块分化5.1个丛生芽。
（5）生根诱导培养：将继代增殖形成的丛生芽分割成单株后接种到生根培养基上。培养基配方为：1/2ms+12g/l琼脂+30g/l蔗糖+500mg.l-1花宝1号+1.0g.l-1ac+1.2mg.l-1iba+0.1mg.l-16-ba，ph值6.0。共接种7500个单芽，培养20天后开始产生根系，30天后全部生根，每株产生根系5根以上。
（6）各阶段培养条件为：温度24～26℃，光照为1500～2000lux，光照时间为12～14h/d。
（7）瓶苗移栽：2016年8月下旬，将苗高8cm、根系5根以上瓶苗揭开瓶盖，每瓶加入15ml蒸馏水，带瓶移入遮荫率70%的大棚，在自然变温条件下炼苗培养10d；同时将蛭石+砂质黄壤混合基质（体积比为1∶2）用3000mg.l-1的多菌灵水溶液消毒处理后装入5cm×8cm的营养袋中；将炼苗后的瓶苗取出，用水清洗净根系，置于有少量水分的磁盘中，将幼苗植入已消毒装袋的基质中，每袋1株；将植苗营养袋挨个放入宽度1m，深度0.2cm的泥底苗床中，然后浇透水；在苗床上搭0.5m高小拱棚，上覆白色地膜和50%遮阳网。共移栽定植7500株，2016年10月上旬检查，成活率91.0%；先揭开小拱棚两端炼苗10天，然后全部撤掉小拱棚越冬，2017年3月下旬，新芽萌发后再露天定植，成活率90.0%以上。