本发明涉及西红花的组织培养法，特别是一种西红花的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
西红花，因为它的柱头可以用作香料和药物治疗疾病而广泛种植，同时可以广泛应用于制药、食品加工和着色等行业。然而，西红花的花不育，不能产生有活力的种子。传统的繁殖体系，如通过分球繁殖速度缓慢，且导致病毒的积累，影响西红花的品质，因此期待通过组织培养繁殖从而提供了一种潜在而有效的方法。
技术实现要素：
本发明要解决的技术问题是提供一种西红花的组织培养法，采用该方法能获得大量的西红花组培种苗。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种西红花的组织培养法(西红花的组织培养快速繁殖方法)，包括以下步骤：
1)、取生长健壮且无病虫害的西红花球茎，掰下侧芽(长度约1～2cm)后流水冲洗；
2)、愈伤组织的诱导：
将上述流水冲洗后的西红花球茎侧芽经消毒(常规消毒)后，切割成长度为3～5mm，横放接种到愈伤组织诱导培养基上进行培养，直至形成簇状生长的愈伤组织；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
3)、不定芽诱导：
将步骤2)所得的愈伤组织分割成长度为0.5～1cm的小块；将小块愈伤组织接种到诱导不定芽培养基上进行培养，直至小块愈伤组织长出0.6～1.1cm的不定芽；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为25±1℃；8小时暗培养，温度为21±1℃；上述光照和暗培养交替进行；
4)、小球茎培养：
割取步骤3)所得的不定芽作为单株小苗，将此小苗接种到球茎诱导培养基中，从而使其进一步发育成至少有一条长度≥0.9cm根的小球茎ⅰ；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmolm-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行；
5)、壮苗培养：
将上述小球茎ⅰ接种到壮苗培养基上进行壮苗培养，培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmolm-2·s-1，温度为22～26℃；8小时暗培养，温度为20～22℃；上述光照和暗培养交替进行，直至获得至少有2条长度≥0.9cm根的小球茎ⅱ。
注：此小球茎ⅱ直径约2cm，根的数量一般为2～3根；此小球茎ⅱ可出瓶种植进行移栽。
作为本发明的西红花的组织培养法的改进，步骤2)的愈伤组织诱导培养基：ms+6-ba5～10mg/l+naa1～2mg/l+白砂糖20～30g/l+琼脂7～9g/l，ph为5.5～6.0。
愈伤组织诱导培养基的制作方法具体如下：以ms基本培养基为基础，分别加入6-苄基腺嘌呤(6-ba)、萘乙酸(naa)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1l的ms基本培养基中加5～10mg的6-ba、1～2mgnaa、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
作为本发明的西红花的组织培养法的进一步改进，步骤3)的不定芽诱导培养基：ms+tdz0.5～1mg/l+pic1～2mg/l+白砂糖20～30g/l+琼脂7～9g/l，ph为5.5～6.0。
不定芽诱导培养基的制作方法具体如下：以ms为基本培养基为基础，分别加入噻苯隆(tdz)、毒莠定(pic)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1lms基本培养基中加0.5～1mg噻苯隆(tdz)、1～2mg毒莠定(pic)、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
作为本发明的西红花的组织培养法的进一步改进，
所述步骤4)的球茎诱导培养基：ms+naa1mg/l+白砂糖20～30g/l+琼脂7～9g/l，ph为5.5～6.0；
所述步骤5)的壮苗培养基：1/2ms基本培养基+1mg/lnaa+白砂糖15～30g/l+琼脂7～9g/l，ph为5.5～5.8。
球茎诱导培养基的制作方法具体如下：以ms基本培养基为基础，分别加入naa、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～6.0；每1l的ms基本培养基加入1mg的naa、20～30g白砂糖、7～9g琼脂。
壮苗培养基的制作方法具体如下：以1/2ms基本培养基(即溶液中大量元素的含量为ms基本培养基的一半)为基础，分别加入萘乙酸(naa)、白砂糖、琼脂均匀混合，利用1mol/l的koh或1mol/l的hcl调节ph为5.5～5.8；每1l的1/2ms基本培养基中加1mg萘乙酸、15～30g白砂糖、7～9g琼脂。
作为本发明的西红花的组织培养法的进一步改进，所述步骤1)为：先将侧芽放入质量浓度为0.8～1.2％的洗衣粉水溶液中浸泡20～40min(例如为30min)，然后再将侧芽放入纱袋中用自来水冲洗1～2小时。
在本发明中，作为优选的培养基如下：
愈伤组织诱导培养基：ms+6-ba10mg/l+naa1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
不定芽诱导培养基：ms+pic1mg/l+tdz1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
球茎诱导培养基：ms+naa1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
壮苗培养基：1/2ms基本培养基+1mg/lnaa+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
更优选的培养基为：
愈伤组织诱导培养基：ms+6-ba10mg/l+naa2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
不定芽诱导培养基：ms+pic2mg/l+tdz1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
依照上述方法，只需90～110天即可获得试管苗；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。
本发明的西红花组织培养法，属于一种离体快速繁殖的组织培养方法。依照植物组织培养中细胞全能性的原理，利用侧芽可以在短时间内产生大量遗传背景相同、长势一致的优质西红花，而且依靠实验室可以实现周年的长期提供优质种苗。在本发明的方法中，将长势健壮且无病虫害的西红花球茎上取得的侧芽进行消毒，通过合适的诱导培养基进行诱导不定芽以及诱导小球茎，可以获得大量的无菌苗。采用本发明的方法，一般仅需90～110天即可得到可出瓶种植的种苗。因此西红花组培苗一周年内的繁殖系数理论上为35倍以上。所以，本发明的西红花的组织培养法，是一种不受季节等因素影响，高效、快速提供优质西红花，克服了西红花常规栽培方法繁殖缓慢的缺点。
综上所述，本发明建立的西红花组织培养体系将为良种(西红花球茎)繁育提供理论依据和技术支撑。
在本发明中：
1)、本发明利用西红花侧芽作为外植体，诱导愈伤组织容易；进行壮苗培养能够大大提高西红花的移栽成活率；西红花侧芽对外源激素比较不敏感，外源激素(愈伤组织诱导培养基中所使用的激素)浓度稍高，有利于西红花侧芽伤口愈合，长成愈伤组织。因此，本发明在愈伤组织阶段培养中采用了较高浓度的植物激素培养，建立质优量大的繁育体系，在后几个阶段采用了相对较低的植物激素培养，保证了培养过程中培养物体内外源激素的积累水平比较低，从而保障了较高的增殖系数和代数。
2)、本发明对侧芽插入培养基的方式进行了比较，发现将侧芽横放在培养基上有利于愈伤组织的产生。
3)、愈伤组织呈现出不同的形态，且有胚性与非胚性之分。非胚性不适合用来大量诱导不定芽，容易影响增殖系数。本发明利用胚性愈伤组织来诱导，增殖系数大。
备注说明：胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织通过肉眼从形态区分后，通过切片观察能轻易加以区分。如图8所示：
根据愈伤组织的形态不同，将愈伤组织分为a、b两类，如图8所示，a1、a2、a3分别为a愈伤组织dapi、甲苯胺蓝以及亚甲基蓝切片观察照片，b1、b2、b3分别为b愈伤组织dapi、甲苯胺蓝以及亚甲基蓝切片观察照片，dapi染色发现，a愈伤组织细胞核物质浓厚，b愈伤组织几乎观察不到核物质；甲苯胺蓝染色显示a愈伤组织细胞排列紧密，b愈伤组织细胞排列疏松；半薄切片亚甲基蓝染色显示a愈伤组织有明显的维管束和次生导管壁分化，而b愈伤组织内部无任何分化迹象，因此通过不同染色观察我们得出a类愈伤组织为胚性愈伤组织，b类为非胚性愈伤组织。
4)、本发明在球茎长成后利用壮苗培养基培养，有利于增加根的粗壮度和根的数量，有利于提高移栽成活率。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为实施例1中所诱导出来的西红花愈伤组织；
图2为实施例1中愈伤组织所诱导出来的西红花不定芽；
图3为实施例1中经过继代培养后的小苗；
图4为实施例2中侧芽诱导的愈伤组织；
图5为实施例2中愈伤组织诱导的丛生芽；
图6为实施例2中丛生芽经过诱导以后产生的小球茎；
图7为实施例2中壮苗培养基上生长的完整植株。
图8为胚性愈伤组织和非胚性愈伤组织的对比图。
具体实施方式
下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明的保护范围不仅限于这些实施例。
实施例1：一种西红花的组织培养法，依次进行以下步骤：
1)、取生长健壮且无病虫害的西红花球茎，掰下侧芽(长度约为1～2cm)，先将侧芽放入质量浓度为1％的洗衣粉水溶液中浸泡30min，再放入纱袋中用自来水冲洗1～2小时；
2)、愈伤组织的诱导：
将上述流水冲洗后的侧芽经常规消毒后(即0.1％w/vhgcl2处理6～8分钟后，无菌水冲洗5～6遍，然后用无菌滤纸吸干)，水平放置在愈伤组织诱导培养基上进行培养；直至形成簇状生长的愈伤组织；培养时间约60天。
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
愈伤组织诱导培养基：ms+6-ba10mg/l+naa1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
胚性愈伤组织诱导率为73％。
备注说明：剩余的27％为非胚性愈伤组织；胚性愈伤组织诱导率＝胚性愈伤组织数/总诱导愈伤组织数。
3)、不定芽诱导：
将步骤2)所得的愈伤组织切成0.8～1cm左右大小，然后将小块愈伤组织接种到不定芽诱导培养基上进行培养；直至小块愈伤组织长出约1.0cm的不定芽；培养时间约30天；
培养条件为：16小时光照，光照强度30～40μmolm-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
不定芽诱导培养基：ms+tdz1mg/l+pic1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
不定芽诱导率为67％；
备注说明：不定芽诱导率＝长出的不定芽数/总愈伤组织数*100％。
4)、球茎诱导(小球茎培养)：
割取步骤3)所得的不定芽作为单株小苗，将此小苗接种到球茎诱导培养基中，从而使其进一步发育成至少有一条长度≥0.9cm根的小球茎ⅰ；时间约20天；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmolm-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
球茎诱导培养基：ms+naa1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.6。
5)、壮苗培养：
将小球茎ⅰ接种到壮苗培养基上培养，直至获得有2～3条长度≥0.9cm根的小球茎ⅱ(此小球茎ⅱ直径约2cm)；
培养条件为：16小时光照，光照强度40～50μmolm-2·s-1，温度为(25±1)℃；8小时暗培养，温度为(21±1)℃；上述光照和暗培养交替进行；
壮苗培养基：1/2ms基本培养基+1mg/lnaa+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
6)、移栽：
上述长根后的小球茎ⅱ后，可按照常规方式进行出瓶种植。
依照上述方法，只需110天即可获得试管苗，相比传统栽培方式，不需要经过休眠的过程，节省了大量时间；因此采用本发明的方法可以长期得到大量的试管苗。存活率≥95％。
实施例2：
相对于实施例1而言，在步骤2)～3)中所用到的培养基中激素做了调整，即为：
不定芽诱导培养基：ms+tdz1mg/l+pic2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
愈伤组织诱导培养基：ms+6-ba10mg/l+naa2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
其余等同于实施例1。
所得结果为：
在步骤2)的诱导愈伤组织培养过程中，胚性愈伤组织诱导率达89％。
在步3)不定芽诱导培养中，不定芽诱导率为76％。
该实施例2与实施例1相比较，在愈伤组织诱导、不定芽诱导上调整了激素浓度。
对比例1、将实施例1步骤3)中的“水平放置在愈伤组织诱导培养基上进行培养”更改成“将该侧芽直立接种到愈伤组织诱导培养基进行培养”。其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：侧芽不会产生愈伤组织，侧芽长高后萎缩死亡。
对比例2、将实施例1步骤2)中的愈伤组织诱导培养基的配方更改为：ms+6-ba5mg/l+naa2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：需要70天才能有成愈伤组织产生，且胚性愈伤组织诱导率为63.3％。
对比例3、将实施例1步骤2)中的愈伤组织诱导培养基的配方更改为：ms+6-ba4mg/l+naa1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：胚性愈伤组织诱导率仅为55％，且愈伤组织呈黑色海绵状，不易诱导成不定芽。
对比例4、将实施例1步骤3)中的不定芽诱导培养基的配方更改为：ms+6-ba3mg/l+pic1mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：不定芽诱导率仅为37％，大部分愈伤组织死亡。
对比例5、将实施例1步骤3)中的不定芽诱导培养基的配方更改为：ms+6-ba3mg/l+pic2mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：不定芽诱导率仅为41％，大部分愈伤组织死亡。
对比例6、将实施例1步骤3)中的不定芽诱导培养基的配方更改为：ms+ba3mg/l+白砂糖25g/l+琼脂8g/l，ph为5.8。
其余等同于实施例1。
最终所得的结果为：不定芽诱导率仅为13％，大部分愈伤组织死亡。
对比例7、取消实施例1步骤5)的壮苗培养，即，将小球茎ⅰ直接进行相应的移栽种植，2个月后，其存活率仅为70％；而本发明的存活率达到95％以上。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。