本发明涉及一种基于花药培养的红掌脱毒方法，尤其涉及一种通过花药离体培养途径高效获得红掌脱毒种苗的方法，属于园艺科学领域。
背景技术：
红掌(anthuriumandraeanumlinden)又名花烛、安祖花，为天南星科花烛属多年生常绿草本植物，红掌的叶呈心形、墨绿、革质、有天鹅绒般的金属光泽，叶柄纤细硬朗；红掌的花朵由鲜猩红色的佛焰苞和橙红色的肉穗花序组成，花序螺旋状卷曲，花苞蜡质、形似手掌，整朵花光彩夺目，风姿楚楚，给人以明快、热烈的感受；红掌的花梗韧性好，每朵花的花期一般可达一个月，全年均可开花，因此红掌是一种较为珍稀的观花观叶两者兼宜的观赏植物，具有极高的观赏价值。
野生红掌原产于哥斯达黎加、哥伦比亚等热带雨林区，常附生在树上，有时附生在岩石上或直接生长在地上，1896年由法国著名植物学家自哥伦比亚西南部的热带雨林引种到欧洲，20世纪60年代盛行欧美各国，此后欧洲、亚洲、非洲皆有广泛栽培，在许多国家和地区已经成为仅次于热带兰的主要热带切花品种。目前，荷兰、夏威夷、毛里求斯是世界红掌的主要生产中心，而我国红掌产业虽然起步较晚，但近年来发展迅速。随着红掌生产规模的不断扩大以及人们对红掌的喜爱持续升温，红掌如今已成为了国内主要的盆栽花卉和切花；此外红掌还具有净化空气的作用，不仅可以吸收人体排出的废气(氨气、丙酮)，还可以吸收装修残留的各种有害气体如甲醛等，同时可以保持空气湿润，是室内盆栽的优选，因此红掌栽培有着广泛的应用前景和很高的经济价值。
红掌的繁殖方式有播种繁殖、扦插繁殖、分株繁殖以及组织培养这几种。播种繁殖法一般在育种中才使用，由于红掌自然授粉不良，需经人工授粉才能得到种子，而且播种苗需培育3-4年才能开花，难以满足市场推广的需求。扦插、分株以及组织培养均属于无性繁殖方法，前两者繁殖系数较低，很难满足规模化生产所需的种苗。常规的组织培养方法虽然能在较短的时间繁殖出大量红掌组培苗，但这些组培苗并未脱毒，在长期的无性繁殖中红掌体内会逐渐积累大量病毒，如芋花叶病毒(dsmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)、马铃薯y病毒组等，从而导致植株发生病毒病。病毒病对红掌的危害表现主要有：花叶萎缩扭曲，有坏死斑，植株矮化或黄化，肉穗状花序干枯，严重时整株枯死，这些危害严重影响了红掌的品质和产量，制约了我国红掌商品化的发展。因此，研究红掌的脱毒技术，生产无病毒种苗，成为红掌产业所面临的一个重要问题。
目前，生产上使用的脱毒方法主要有热处理法脱毒、茎尖组织培养脱毒、抗病毒化学药剂脱毒以及茎尖微嫁接脱毒等。这些方法虽然能普遍适用于各科植物，但也都有一定的不足之处：热处理法脱毒对处理的时间和温度有着很高的要求，随着处理时间的延长和温度的提高脱毒也效果越好，但与此同时植物的存活率就越低；茎尖组织培养脱毒和茎尖微嫁接脱毒的效果与茎尖大小密切相关，一般认为茎尖越小脱毒效果越好，但成活率也随之降低；重复切取茎尖也是获取无病毒苗、提高脱毒效果的一种手段，但此种方法所需时间较长，操作步骤繁琐，工作效率低；抗病毒化学药剂脱毒通常也需要与茎尖组织培养结合起来应用，单独使用不能达到很好的效果。当前红掌脱毒技术还处于起步阶段，关于红掌脱毒方面的研究很少，而且脱毒方法还不完善，在专利网上仅检索到授权公告号为cn104542276b的中国专利，公开了一种红掌脱毒培养的方法，该方法虽然脱毒效率较高，但操作步骤繁琐，脱毒苗生产周期较长，不适用于红掌脱毒苗的商业生产。
花药培养脱毒是一种较为新颖的脱毒技术手段，其原理是将花药接种到培养基上进行离体培养，花药中的花粉经过脱分化和再分化的过程可产生完整的植株，而花粉小孢子基本不携带病毒，因此通过花药培养培育的植株脱毒率几乎能达到100%。花药培养脱毒具有脱毒率高、操作简单的优点，若是应用于红掌脱毒无疑是获得红掌无病毒植株的最好途径。
将花药培养脱毒应用于红掌生产仍然有一些需要解决的问题。首先是遗传稳定性。花培再生植株的遗传变异是客观存在的，因此将其用于生产必需严格评价，确保其与取材品种染色体倍性的一致。其次是花药培养再生率较低，主要表现为花药诱导率低以及愈伤组织分化率低，而且不同的品种再生率可能会有较大的差异。本研究团队经过不断的摸索和实践，改善了培养条件，优化了适用于红掌花药培养的不同阶段的培养基，提出了一种简便快捷的判断红掌二倍体植株的方法，最终总结出了一种高效的基于花药培养的红掌脱毒方法。本发明的脱毒方法具有较大的实用价值，能够更好地服务于我国红掌产业。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种操作简单、遗传稳定性高、花培诱导和再生效率高、花培植株倍性鉴定效率高的基于花药培养的红掌脱毒方法。
为了实现上述目的，本发明的技术方案包括以下步骤：
一种基于花药培养的红掌脱毒方法，其特征在于，该脱毒方法的详细步骤如下：
（1）红掌花序的取材与预处理
在10月~11月的晴天上午或阴天早上露水干后取材，将摘得的花序用湿纱布包裹带回实验室，筛选花粉小孢子处于单核中晚期的花序，置于4℃低温预处理3~5d；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花序用自来水冲洗10~20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精浸泡10min，再用无菌水冲洗干净，然后用无菌滤纸吸干表面水分；于解剖镜下用镊子拨开花序取出花药投入0.5%次氯酸钠+2-3滴吐温-80的消毒液中浸泡5~8min，再用无菌水冲洗3~4次后，即获得无菌花药；将无菌花药接种在诱导培养基中，每瓶培养基接种40-50枚花药；
（3）花药诱导培养
将接种了花药的诱导培养基放置于人工气候培养箱中培养，培养条件控制为温度24~26℃，相对湿度65~75％，光照强度1500~2000lux，光照10h/d，培养45~55d可诱导出黄绿色较致密的愈伤组织；
（4）愈伤组织分化培养
无菌条件下将诱导成功的直径为1.0-2.0cm的愈伤组织转接到分化培养基上，置于24~26℃、相对湿度65~75％、光照强度2000~2500lux、光照10~12h/d的培养条件下进行愈伤组织分化培养，培养38~45d后愈伤组织分化出不定芽；
（5）壮苗生根培养
筛选步骤（4）中分化出的不定芽，将高于1.5cm的小芽从愈伤组织上切下，接种到生根培养基上，置于温度22~25℃、相对湿度60~80％、光照强度2000~3000lux、光照12~14h/d的培养条件下进行壮苗生根培养，每30~33d继代一次，继代3次后可得到长出2-3片幼叶、根系生长旺盛的红掌幼苗；
（6）炼苗与移栽
将装有红掌幼苗的组培瓶移到温室中，此时温度控制在20~27℃、湿度控制在75％~85％，将组培瓶的瓶口打开，在自然光光照的条件下炼苗7~9d，然后将幼苗从组培瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室的栽培基质中，常规栽培管理；
（7）红掌单倍体植株的剔除
移栽后的红掌幼苗生长到现蕾期时，将单倍体植株剔除，剩余的则为红掌正常倍性的植株。
所述步骤（1）中筛选花序的方法为：将花粉经dapi(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色确认小孢子发育时期为单核中晚期。
所述步骤（2）和（3）中诱导培养基的配方为：kno31200~1400mg/l，（nh4）2so4385~420mg/l，kh2po4220~260mg/l，mgso4·7h2o175~205mg/l，ca（no3）2200~240mg/l，mnso4·4h2o14~17mg/l，znso4·7h2o2.5~3.5mg/l，h3bo30.8~1.2mg/l，ki1.3~1.5mg/l，cocl2·6h2o0.022~0.026mg/l，na2moo4·2h2o0.2~0.3mg/l，feso4·7h2o26~28mg/l，na2-edta36~38mg/l，肌醇90~110mg/l，蛋白胨32~38mg/l，甘氨酸3.0~4.0mg/l，脯氨酸3.0~4.0mg/l，维生素b10.3~0.5mg/l，维生素b60.4~0.6mg/l，牛磺酸0.4~0.6mg/l，复肽核酸0.5~0.7mg/l，硝酸银1.5~2.0mg/l，乳糖20~24g/l，葡萄糖18~23g/l，硫酸二乙酯2.4~2.8mg/l，5-硝基愈创木酚钠0.4~0.6mg/l，胺新脂0.07~0.10mg/l，亚精胺2.4~3.0mg/l，豌豆提取液30~36ml/l，酵母浸提液13~17ml/l，聚乙烯醇0.8~1.2g/l，植物凝胶2~4g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤（4）中分化培养基的配方为：1/2ms（无蔗糖）+2,4-d1.6~2.0mg/l+茉莉酸甲酯0.05~0.08mg/l+硫酸二乙酯0.7~1.1mg/l+乳糖15~19g/l+葡萄糖10~13g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤（5）中生根培养基的配方为：1/2ms（无蔗糖）+氯化胆碱0.2~0.4mg/l+naa0.7~1.0mg/l+亚精胺3.3~3.6mg/l+乳糖15~19g/l+葡萄糖10~13g/l，ph值为5.6~6.0。
所述步骤（6）中的栽培基质按重量份计为：泥炭18-22份、腐殖土30-35份、玉米秸秆13-17份、花宝1号3-6份、蛭石8-10份。
所述步骤（7）中剔除单倍体植株的方法为：单倍体植株生长矮小，根据植株高度差异，将群体植株高度后15%的植株剔除。
所述步骤（7）中红掌正常倍性植株为二倍体，染色体数2n=30。
本发明的有益效果：
1、本发明通过对红掌花药培养的不断研究，摸索出了能够提高红掌花培诱导和再生效率的培养基，并通过实践总结出了生产上筛选红掌正常二倍体植株的方法，能够满足通过红掌花药培养生产脱毒植株的产业化应用要求。
2、由于红掌花药中的花粉基本不携带病毒，通过花药培养培育的花粉植株几乎能达到完全脱毒的目的；进一步将红掌的未脱毒植株与花粉植株进行病毒检测对比，发现红掌花粉植株病毒检出率极低，脱毒率几乎能达到100%。
3、本发明操作简单，花培植株再生率高，大大缩短了红掌脱毒种苗的生产周期，而且本发明脱毒率高，能够进一步提升红掌的花卉品质，具有较大的经济效益。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解。
实施例
2016年，选择红掌品种‘亚利桑那’、‘大哥大’和‘皇冠’作为本实施例的供试材料进行试验，这3个品种的红掌均来源于云南秀海生物科技有限公司彩云红掌种植基地。
（1）红掌花序的取材与预处理
2016年10月下旬，选择晴天上午取材，将摘得的‘亚利桑那’、‘大哥大’和‘皇冠’3个红掌品种的花序用湿纱布包裹带回实验室，将花粉分别经dapi(4，6-联脒-2-苯基吲哚)染色确认小孢子发育时期，筛选花粉小孢子处于单核中晚期的花序，置于4℃低温预处理4d；
（2）无菌花药的获得与接种
将上述花序用自来水冲洗10~20min，在超净工作台无菌条件下，先用75%酒精浸泡10min，再用无菌水冲洗干净，然后用无菌滤纸吸干表面水分；于解剖镜下用镊子拨开花序取出花药投入0.5%次氯酸钠+2-3滴吐温-80的消毒液中浸泡5~8min，再用无菌水冲洗3~4次后，即获得无菌花药；将无菌花药接种在诱导培养基上（诱导培养基的配方为：kno31300mg/l，（nh4）2so4405mg/l，kh2po4240mg/l，mgso4·7h2o190mg/l，ca（no3）2220mg/l，mnso4·4h2o15mg/l，znso4·7h2o3.0mg/l，h3bo31.0mg/l，ki1.4mg/l，cocl2·6h2o0.025mg/l，na2moo4·2h2o0.25mg/l，feso4·7h2o27mg/l，na2-edta37mg/l，肌醇100mg/l，蛋白胨35mg/l，甘氨酸3.5mg/l，脯氨酸3.6mg/l，维生素b10.4mg/l，维生素b60.5mg/l，牛磺酸0.5mg/l，复肽核酸0.6mg/l，硝酸银1.7mg/l，乳糖22g/l，葡萄糖21g/l，硫酸二乙酯2.6mg/l，5-硝基愈创木酚钠0.5mg/l，胺新脂0.08mg/l，亚精胺2.7mg/l，豌豆提取液33ml/l，酵母浸提液15ml/l，聚乙烯醇1.0g/l，植物凝胶3g/l，ph值为5.7），每瓶培养基接种40-50枚花药；
（3）花药诱导培养
将接种了花药的诱导培养基放置于人工气候培养箱中培养，培养条件控制为温度25℃，相对湿度70％，光照强度1800lux，光照10h/d，培养50d可诱导出黄绿色较致密的愈伤组织；‘亚利桑那’、‘大哥大’和‘皇冠’3个品种的愈伤组织诱导率分别为38.7%、45.1%和33.0%；
（4）愈伤组织分化培养
无菌条件下将诱导成功的直径为1.0-2.0cm的愈伤组织转接到分化培养基上（该分化培养基的配方为：1/2ms（无蔗糖）+2,4-d1.8mg/l+茉莉酸甲酯0.06mg/l+硫酸二乙酯0.9mg/l+乳糖17g/l+葡萄糖11g/l，ph值为5.8），置于25℃、相对湿度70％、光照强度2300lux、光照11h/d的培养条件下进行愈伤组织分化培养，培养41d后愈伤组织分化出不定芽；
（5）壮苗生根培养
筛选步骤（4）中分化出的不定芽，将高于1.5cm的小芽从愈伤组织上切下，接种到生根培养基上（该生根培养基的配方为：1/2ms（无蔗糖）+氯化胆碱0.3mg/l+naa0.7~1.0mg/l+亚精胺3.4mg/l+乳糖16g/l+葡萄糖12g/l，ph值为5.8），置于温度23℃、相对湿度72％、光照强度2600lux、光照13h/d的培养条件下进行壮苗生根培养，每32d继代一次，继代3次后可得到长出2-3片幼叶、根系生长旺盛的红掌幼苗；
（6）炼苗与移栽
将装有红掌幼苗的组培瓶移到温室中，此时温度控制在20~27℃、湿度控制在75％~85％，将组培瓶的瓶口打开，在自然光光照的条件下炼苗8d，然后将幼苗从组培瓶中取出，清洗掉根部的培养基残留，移栽入温室的栽培基质中，栽培基质按重量份计为：泥炭20份、腐殖土33份、玉米秸秆15份、花宝1号4份、蛭石9份，常规栽培管理；
（7）红掌单倍体体植株的剔除
移栽后的红掌幼苗生长到现蕾期时，由于单倍体植株生长矮小，因此可根据植株高度差异，将群体植株高度后15%的植株剔除，剩余的则为红掌正常倍性的植株；红掌正常倍性为二倍体，染色体数2n=30；
采用根尖压片法对获得的3个品种的红掌植株进行染色体的倍性鉴定，将花培群体中单倍体、二倍体分别进行标记，并统计各种倍性植株所占的比例，统计结果为‘亚利桑那’花培植株中单倍体占13.5%，‘大哥大’单倍体占10.9%，‘皇冠’单倍体占11.4%；移栽后的红掌生长到现蕾期时，染色体倍性为单倍体的植株生长矮小纤弱，二倍体的植株生长正常占大多数，因此可以根据植株高度差异来判断植株的染色体倍性，将群体植株高度后15%的植株剔除，这样剩余的红掌花培植株基本为正常的二倍体植株；
（8）病毒检测
为了证明本发明的脱毒效果，将上述步骤获得的红掌二倍体植株每个品种选择60株进行病毒检测，检测的病毒为红掌常染病毒芋花叶病毒(dsmv)、黄瓜花叶病毒(cmv)，检测方法为rt-pcr法，同时每个品种再选择60株未经脱毒处理的常规栽培植株作为对照组，进行相同的病毒检测，将所有病毒检测的结果统计如下表1。
由表1可以发现，使用本发明的基于花药培养的脱毒方法对红掌的3个品种进行脱毒，2种最常侵染红掌的病毒均未检出，与未脱毒的对照组相比，可以达到完全脱毒的效果。和现有的其他红掌脱毒方法相比，本发明不仅提高了脱毒效率，而且操作简便，技术水平要求低，更适用于红掌的规模化生产。因此，本发明对红掌产业具有极大的实用价值。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何变化，都应认为是包括在权利要求书的范围内。