一种雷公藤的组培快繁方法与流程

本发明涉及组织培养技术领域，具体地说，涉及一种雷公藤的组培快繁方法。

背景技术

雷公藤(tripterygiumwilfordiihook.f.)系卫矛科雷公藤属植物，属多年生藤本落叶灌木，多生于背阴多湿稍肥的山谷、山坡、次生杂木林和溪边灌木林中，喜湿润、温暖、避风的环境。雷公藤为我国道地中药材，主要分布在长江以南的云南、四川、贵州、湖北、浙江、福建、湖南等地。

前期研究发现雷公藤显示出抗肿瘤、抗自身免疫等多方面临床治疗效果，其药理学作用机制也成为近些年的研究热点。通过分离提取、成分鉴定和活性验证等研究发现雷公藤含有多种具有生物学活性的化合物，如雷公藤甲素、雷公藤红素、雷公藤次碱等。其中，雷公藤红素(celastrol)和雷公藤甲素(triptolide)是雷公藤的主要药用活性成分，也是目前研究比较深入且具备较好成药性的天然化合物。它们作用靶点众多，表现出多种重要的生物活性和临床治疗前景：如(1)通过诱导肿瘤细胞凋亡、抑制蛋白酶体活性和抑制新生血管形成等途径抑制多种肿瘤的生长和迁移；(2)通过抑制炎症细胞因子和化学因子等的产生有效治疗类风湿性关节炎等自身免疫病以及降低器官移植时的排异反应；(3)具有抑制神经退行性疾病的作用；(4)由于能强力增强食欲抑制激素的敏感性，被认为是一种潜在的治疗过度肥胖的高效药物；(5)治疗蛋白非正确折叠导致的疾病的潜在药物，如gaucher病等。

从研究进展来看，雷公藤红素和雷公藤甲素衍生物被批准用于临床的可能性极大，其需求量将很大。目前，雷公藤红素和雷公藤甲素尚都不能通过化学合成而大量获取，主要来自于从雷公藤中提取、分离，但由于自然条件下，植株生长缓慢，且分离提取得率低等原因，无法满足大规模应用需求。因此，急需一种雷公藤植株的快速繁殖技术。

植物离体培养和植株再生体系的建立是基因工程育种的重要工作。当前，关于雷公藤离体组织培养和植株快速再生繁殖体系的研究还很匮乏。

刘希华等以带芽茎段作为外植体，进行组织培养，发现芽段在ms+naa0.01mg/l培养基中可萌动产生新叶和新芽；在增殖培养中，以1/2ms+6-ba1mg/l+naa0.2mg/l组合月增殖系数最大，达5.38，且芽生长最好；在生根培养中，以1/2ms+abt-1#0.6mg/l+iba0.3mg/l的生根率最高，达80.8％。李琰等以其胚性愈伤组织为材料，研究了继代培养时间对植株再生和基本培养基、生长素浓度及其与细胞分裂素组合对再生苗增殖的影响，但并未建立完整的雷公藤组织培养再生体系。陈凌艳等以雷公藤带芽幼嫩茎段为外植体，通过诱导丛生芽生根的方法建立了雷公藤植株的快速繁殖技术。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种雷公藤的组培快繁方法。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种雷公藤的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)初代培养：以雷公藤当年生茎段为外植体，诱导茎段腋芽萌发；

(2)生根培养：截取萌发的腋芽，诱导腋芽生根以及茎叶的伸长生长；

(3)增殖培养：将伸长的茎切割成带芽茎段，通过空气生根的方法诱导生根。

作为优选，步骤(3)中，带芽茎段带有1叶1节，培养时，使茎段悬空在培养基上方，叶片接触培养基吸收营养。

进一步地，步骤(1)中，诱导茎段腋芽萌发所使用的培养基为：ms+1.0-2.0mg/l6-ba+0.1-0.3mg/lnaa+28-32g/l蔗糖+6.5-7.5g/l琼脂，ph5.6-6.0。优选为：ms+1.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7。

进一步地，步骤(2)和步骤(3)中，所使用的培养基均为：1/2ms+0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7。

进一步地，所述步骤(1)～(3)的培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光/暗培养12h/12h。

进一步地，所述培养过程中的光照强度为2000-3000lex。

作为优选，所述外植体采用如下方法灭菌：用体积浓度为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗，再用质量浓度为0.1％的氯化汞消毒灭菌3-7min，无菌水冲洗。

更为具体的，本发明所述的组培快繁方法，包括如下步骤：

(1)以雷公藤当年生茎段为外植体，用体积浓度为75％的酒精消毒30s，无菌水冲洗3遍，再用质量浓度为0.1％的氯化汞消毒灭菌10min，无菌水冲洗5遍；

将灭菌后的外植体，接种在诱导培养基上诱导腋芽萌发；

所述诱导培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7；

(2)生根培养：

将诱导分化出的腋芽转接于生根培养基上诱导生根；

所述生根培养基为：1/2ms+0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7；

(3)增殖培养：

将苗高7cm以上、且至少含有两个节段的生根苗切割成1叶1节，转接于上述生根培养基上进行增殖；

所述步骤(1)～(3)的培养条件为：环境温度23±1℃，湿度70％±5％，光/暗培养12h/12h。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明提供了一种雷公藤的组培快繁方法，以雷公藤幼嫩茎段为外植体，基于气生根通过茎段快速繁殖雷公藤植株，此方法操作方式简易，培养基简单，培养周期短，可同步实现增殖及生根，节约了成本，为雷公藤的工厂化育苗提供技术理论依据，并为以后遗传转化和品种改良等研究奠定基础。

附图说明

图1为本发明实验例1中雷公藤的腋芽生根培养。

图2为本发明实验例1中基于气生根的雷公藤幼苗的继代增殖培养初期。

图3为本发明实验例1中基于气生根的雷公藤幼苗的继代增殖成苗。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

1、材料与方法

1.1材料来源

试验材料来自于四川省七彩林业开发有限公司苗圃的优良雷公藤幼苗。在预实验中，对不同外植体进行了培养效果的对比，表明当年生茎段诱导腋芽萌发效果最佳，因而在后续试验中，均选取健康的当年生茎段作为外植体，剪取后需在当日内接种。

1.2外植体消毒灭菌处理

将采取的雷公藤茎段剪成2-3cm的带芽茎段，用清水洗净表面附着物，置于洗涤剂中浸泡20min，再用流水冲洗30min后，将其置于超净工作台上，再用无菌水清洗若干遍后使用不同处理方法进行消毒：(1)先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用0.1％升汞灭菌5min，再用无菌水清洗5遍；(2)先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用0.1％升汞灭菌10min，再用无菌水清洗5遍；(3)先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用1％次氯酸钠灭菌5min，再用无菌水清洗5遍；(4)先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用1％次氯酸钠灭菌10min，再用无菌水清洗5遍。将上述消毒灭菌后的外植体接种于ms基本培养基上培养，每瓶1株，每个处理接种30瓶，3个重复。培养条件为温度23±1℃，湿度70％±5％，光/暗培养12h/12h，光照强度为2000-3000lex。7d后统计污染率。

1.3初代培养

使用筛选后的最佳消毒灭菌方式，将外植体消毒灭菌后，接种于添加不同激素的培养基上，以期获得最佳的初代诱导培养基。本实验采用ms基本培养基+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7，通过添加不同激素，将灭菌后的外植体接种于含有不同激素的培养基上，每瓶1株，每个处理接种30瓶，3个重复，30d后观察萌发情况。培养条件同上(1.2节)。

1.4生根培养

将诱导好的腋芽转接于生根培养基上诱导生根成苗。为筛选最佳生根培养基，本实验采用1/2ms基本培养基+3g/l浓度的活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7。通过添加不同激素，将萌发后的腋芽转接于培养基上，30d后观察生根情况。每瓶1株，转接30瓶，3个重复。培养条件同上(1.2节)。

1.5增殖培养

本实验采用节段法增殖。将生根后苗高7cm以上，至少含有两个节段的组培苗切割成1叶一节，转接于上述筛选出的最佳生根培养上进行生根培养。生根方式为培养基上生根及气生生根两种方式。气生生根方式即将修剪后的茎段竖放于培养基上，但茎段不直接接触于培养基上，而是利用叶片的支撑作用，使茎段悬空在培养基上1cm左右的位置上，叶片直接接触培养基吸收营养。30d后统计生根情况。培养条件同上。

2、结果与分析

2.1外植体灭菌

采用雷公藤当年生茎段(幼嫩茎段)作为外植体，剪成2-3cm带芽茎段，分别用不同的处理方式进行消毒，消毒效果如表1所示。

处理方式分别如下：

处理方式(1)：先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用0.1％升汞灭菌5min，再用无菌水清洗5遍；

处理方式(2)：先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用0.1％升汞灭菌10min，再用无菌水清洗5遍；

处理方式(3)：先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用1％次氯酸钠灭菌5min，再用无菌水清洗5遍；

处理方式(4)：先用75％酒精消毒30s，再用无菌水清洗3遍，再用1％次氯酸钠灭菌10min，再用无菌水清洗5遍。

其中，处理方式(2)的灭菌效果最好，平均污染率只有3％。

表1不同处理对外植体的消毒效果比较

2.2初代培养

将消毒灭菌好的带芽茎段接种于含有不同激素的培养基上，诱导腋芽萌发。20d腋芽萌发情况见表2。结果显示，添加了1.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa+30g/l蔗糖+7g/l琼脂，ph5.7的ms培养基上，腋芽诱导效果最好。萌发率最高，达98.7％，芽的长度最长，达3.6cm。有部分萌发出丛生芽，但状态不好，不适合进一步继代培养。

表2不同激素添加的培养基诱导20d腋芽萌发情况

2.3生根培养

待腋芽长度长到3cm后，将诱导萌发的腋芽转接于生根培养基上，比较不同的基础培养基添加成分对腋芽生根的影响。如表3所示，结果显示，所有培养基生根率普遍不好，添加0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的1/2ms培养基诱导生根效果在实验培养基中最好，生根率仅70.8％，而且诱导时间较长。后期观察，随着时间的增加，部分腋芽会继续生根，但培养时间过长。

表3不同激素添加的培养基对腋芽生根的影响

2.4基于气生根的雷公藤幼苗的继代增殖培养

待上述雷公藤幼苗长出有3-4个节段后，可进行继代增殖培养。将切割带芽茎段转接于同样的添加0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的1/2ms培养基上，通过叶子的支撑作用使茎段的一个切点悬空在培养基上方约1cm的位置，而不直接接触培养基，诱导移植茎段空气生根。放置于温度23±1℃，湿度70％±5％，光/暗培养12h/12h的条件下培养。7天后，茎段靠近培养基的切点会形成膨大的愈伤组织，并长出生根点。20天后，即有根伸长出来。25天后，根伸长并进入到培养基中。添加0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的1/2ms培养基可同时实现雷公藤组织的增殖培养和生根培养。继代增殖培养植株生根的效率达到91.5％。气生根伸长进入培养基后生长旺盛。幼苗在培养40d后可普遍生长至8-10cm，枝叶茂盛，即可进行炼苗移栽。

表4比较空气生根和培养基内生根方法对生根状态的影响

每组试验有三个重复，取平均值。

2.5炼苗移栽

待组培苗高度达到6～8cm时开始炼苗，先闭瓶炼苗3d，然后将瓶盖打开，置温室散射光下炼苗3d，然后移栽至经高温灭菌的混合红壤土、泥炭土和沙子(比例约为45％：45％：10％)的炼苗基质中。生长25d左右可带土移栽到田间。炼苗环境为温度25±1℃，湿度70％±10％，炼苗移栽成活率达到85.2％。

3、小结与讨论

本研究建立了一种新的基于气生根的雷公藤植株的快速繁殖方法。试验结果表明：外植体经75％酒精浸泡30s后，用无菌水冲洗3遍，0.1％升汞溶液浸泡10min，无菌水冲洗5遍的消毒效果较好，雷公藤组织培养苗的污染率为5％；诱导腋芽萌发的最佳培养基为添加了1.5mg/l6-ba+0.2mg/lnaa的ms培养基，培养条件为温度23±1℃，湿度70％±5％，光/暗培养12h/12h，腋芽的萌发率为98.3％；诱导茎段快速生根的最佳培养基为添加了0.2mg/lnaa+0.1mg/liaa+3g/l活性炭+30g/l蔗糖+7g/l琼脂的1/2ms培养基，诱导条件为将茎的截点悬空于距离培养1cm的空气中培养，根的萌发效率能达到91.5％。

此雷公藤体外培养体系的月增殖系数可达到3.8，切割带芽茎段转接于诱导生根培养基上，可同时快速实现增殖培养和生根培养。后续继代培养6个月，该繁殖体系无明显退化，幼苗生长旺盛，植株叶型与初代培养无明显变化，根系发达，体现了遗传的稳定性。

与李琰等报道的雷公藤胚性愈伤组织再生植株的增殖方法相比，本文报道的方法不需要诱导愈伤组织的形成，形成幼苗的时间更短(继代培养20d左右)，过程简单，而且遗传稳定性高。与陈凌艳等的快速繁殖技术相比，本方法的月繁殖系数稍低，但是在继代增殖培养过程，本研究方法使用与诱导腋芽生根相同的培养基，而且通过直接将原代培养的幼苗根据叶节截为几段后转接新的生根培养基，可实现雷公藤植株的快速繁殖。方法简单，繁殖效率较高，不易污染。正确放置的茎段空气生根的效率可达到将近100％，且后续植株生长旺盛，保证了后续雷公藤幼苗的生长和炼苗的过程。

后续研究可通过分离提取并确定炼苗移栽后的雷公藤植株中的雷公藤红素和雷公藤甲素等次生代谢产物并分析其含量，进一步评价本快速繁殖方法的有效性，为雷公藤的工厂化育苗提供技术理论依据，并为以后遗传转化和品种改良等研究奠定基础，最终满足医药领域对于雷公藤以及其有效化学成分的需求。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。