一种乌菜耐寒性的快速鉴定方法与流程

本发明涉及的是乌菜育种领域，尤其涉及的是一种鉴定乌菜耐寒性的方法。

背景技术：

乌菜(brassicacampestrisl.ssp.chinensisvar.rosularistsenetlee.)是长江-淮河流域重要的蔬菜作物，是十字花科芸薹属芸薹种白菜亚种的一个变种,以墨绿或黄绿色叶片为主的二年生草本植物，具有很高的营养价值。乌菜一般在深秋或冬季栽培。虽然乌菜喜凉爽气候，但在较低温度下也会受到低温胁迫，从而抑制其正常生长。不同基因型的乌菜对寒冷的反应不同，一些表现出一定程度的耐受性，而另一些则极度敏感。随着乌菜栽培面积的逐年扩大，耐寒品种的选择是乌菜栽培的热点之一。找到一种快速有效的方法，在大量的乌菜基因型中选择出耐寒性较强的，并确定适合一些地区栽培的基因型，从而提高乌菜种植面积和产量。

当前许多作物对耐寒品种的选择大多基于目标环境下的主观视觉评分或产量测量，但如何在受控环境下使用方便快捷的选择技术是目前乌菜耐寒基因型选择的重点。以往关于评价不同作物耐寒性的指标和方法有：利用比叶面积和地上部生长速率在田间筛选耐寒的芒草基因型；气孔限制从而抑制光合作用作为大豆耐寒基因型的筛选；抗坏血酸和脯氨酸含量在耐寒性和冷敏感性鹰嘴豆基因型中差异较大；利用耐寒指标建立耐寒性数学评价模型对棉花在低温前后进行耐寒性评价；多基因型冬瓜进行低温处理，利用冷害指数进行评价其耐寒性。然而，这些指标和方法对于大量作物基因型的耐寒性筛选并不方便和快速。

已知光合作用对冷害高度敏感，并且是植物代谢的主要部分。研究表明，冷应激的主要目标位于光系统ii(psii)的反应中心。在过去，许多研究仅使用fv/fm的比率作为筛选作物耐寒性的参数。然而，在后来的研究中，越来越多的证据表明fv/fm对冷害不敏感，也不能用作合适的耐寒性鉴定参数。

因此，如何实现多种基因型乌菜之间耐寒性的快速筛选与比较，是急需解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种乌菜耐寒性的快速鉴定方法，以解决现有技术中多种基因型乌菜之间耐寒性无法快速鉴定的问题。

本发明提供一种乌菜耐寒性的快速鉴定方法，该方法包括以下步骤：

步骤1、将多种基因型的乌菜的种子在同一条件下同时培育；

步骤2、测定同时期的各个基因型对应乌菜的piabs值；

步骤3、对测定的piabs值进行排序；

步骤4、对多基因型乌菜之间对冷胁迫的耐受性进行比较，其中：高piabs值所对应基因型的乌菜对冷胁迫的耐受性相比于低piabs值所对应基因型的乌菜对冷胁迫的耐受性高。

进一步，所述piabs采用连续激发式荧光仪测定。

本发明具有如下有益效果：

本发明提供的乌菜耐寒性的快速鉴定方法，通过根据同期测定各个基因型对应乌菜的piabs值，可直接根据piabs值的大小直接判断各个基因型的乌菜之间冷胁迫的耐受性的强弱，操作简单、便捷，实现了多基因型乌菜之间冷胁迫的耐受性的快速判断，有助于对冷胁迫耐受性高的乌菜的基因型的筛选。

附图说明

图1基于piabs(苗期和成株期)选定的基因型。误差线表示se(n＝3)，数值相同的字母在p<0.05没有显著的不同；

图2为20种乌菜基因型在20℃/15℃(d/n)处理(a)和5℃/0℃(d/n)处理(b)下的piabs和净光合速率相关性图；

图3为20种乌菜基因型在20℃/15℃(d/n)处理(a)和5℃/0℃(d/n)处理(b)下的piabs和电解质渗透率(ec)相关性图；

图4为20种乌菜基因型在20℃/15℃(d/n)处理(a)和5℃/0℃(d/n)处理(b)下的piabs和比叶面积(sla)相关性图；

图5为20种乌菜基因型在20℃/15℃(d/n)处理(a)和5℃/0℃(d/n)处理(b)下的piabs和丙二醛含量(mda)相关性图；

图6为20种乌菜基因型在5℃/0℃(d/n)处理下的piabs和冷害指数(cii)相关性图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本实施例通过下述方法验证本发明提出的一种乌菜耐寒性的快速鉴定方法的有效性

主要包括以下步骤：

一、根据piabs进行筛选乌菜基因型

将124种乌菜基因型的种子播种在无土基质[泥炭/蛭石(体积＝2/1)]中，之后移入人工气候室，随机排列，保证每种基因型重复至少6次。最初在温度为25/18℃，300μmolm^-2s^-1的光强，相对湿度设定为75％日/夜，14/10h日/夜循环的条件下生长。幼苗在温暖条件下生长30天后，所有基因型中的一半被移入田间继续种植，方便在成株期测量成株阶段的piabs数值，剩下的一半在人工气候室将温度降至6℃继续生长12小时后测定各基因型的piabs。

piabs的获得：handypea植物效率分析仪，也就是连续激发式荧光仪。

handypea植物效率分析仪是可以快速测定叶绿素荧光诱导动力学曲线和光合作用psⅱ一系列荧光参数的仪器。

仪器是由叶夹和主机组成，在对植物进行测定时，先用叶夹夹住除主叶脉的叶片部分，对叶夹夹住的叶片部分进行30min的暗适应。暗适应结束后使用主机测定，拉出叶夹上的不锈钢滑片，使叶片暴露在主机的测定窗口中，2s即可测定结束，对叶片无任何伤害，且适用于植物的任何生殖生长阶段。测定的结果可以通过蓝牙链接电脑进行导出。

piabs是一个以吸收光能为基础的性能指数，是光和性能指标的多参数表达，表达式为其中abs/rc为单位反应中心吸收的光能，rc/abs为abs/rc的倒数，为最大光化学效率，ψo为捕获的激子将电子传递到电子传递链中超过qa的其它电子受体的概率。piabs的获得可以通过handypea植物效率分析仪测定直接导出，也可以根据公式计算。

根据piabs值选择20种乌菜基因型(10个低piabs基因型和10个高piabs基因型)(表1和图1)。

表1筛选出的20种乌菜基因型

表1中：ch-ah-hf―中国安徽合肥；ch-ah-la―中国安徽六安；ch-ah-hn―中国安徽淮南；ch-ah-fy―中国安徽阜阳；ch-js-ha―中国江苏淮安；ch-js-sq―中国江苏宿迁；ch-hn-xy―中国河南信阳；ch-hb-lhk―中国湖北老河口；ch-sx―中国山西；ch-sd―中国山东。

20种乌菜基因型在人工气候室内重新种植。所有的生长条件和上述一致。生长30天后进行8天的梯度降温：

阶段一：20/15℃昼/夜，缓苗两天；阶段二：15/10℃昼/夜，低温两天；阶段三：10/5℃昼/夜，低温两天；阶段四：5/0℃昼/夜，低温两天。

每个温度处理后测其piabs，并在阶段一和阶段四处理结束后进行净光合速率(a)、电解质渗透率(ec)、冷害指数(cii)、比叶面积(sla)、丙二醛含量(mda)测定计算。

二、耐寒指标的测定方法

1、净光合速率测定

使用便携式光合作用测定仪(li-6400，li-corinc.，usa)从乌菜顶部的第三或第四片完全展开的叶子上测量净光合速率。在晴天的上午09:00至11:00之间，每次进行10次重复测量。测量期间的条件相对湿度为70％，外部co2浓度为380±10μmolmol^-1，光强度为1000μmolm^-2s^-1。

2、电解液渗透率测定

根据bajjim等人(plantgrowthregulation,2002,36(1):61-70)的方法测量乌菜叶片的电解质渗透。用半径为5.5mm的打孔器对叶子进行打孔(打孔时需要避开叶片主叶脉)。将叶圆盘置于20ml试管中，试管中盛有12ml去离子水，然后在振荡台上25℃振荡30分钟。此时，使用thermoorionstara-hb电导率仪测量水的电导率(ec1)。试管在沸水浴中加热30分钟，然后冷却至室温，再次测量其电导率(ec2)。电解质渗透率表示为ec1/ec2的百分比。

3、比叶面积(sla)的测定

确定sla的方法基于jiao等人(annalsofbotany,2016,117(7):1229-1239)。使用直径为110mm的打孔器，从乌菜的功能叶(通常是从顶部算起的第三或第四片叶)切下10片面积为0.95cm²的叶盘。将取出的叶盘在85℃下烘箱干燥2天并称重。计算sla：sla＝叶面积/叶干物质重。

4、丙二醛含量(mda)的测定

采用hu等人(scientiahorticulturae,2018,237:184-191)的方法对乌菜叶片的mda含量进行测量。1g新鲜的叶子加入少量石英砂和10％三氯乙酸2ml，研磨至匀浆，再加8ml10％三氯乙酸进一步研磨，匀浆以4000r/min离心10min。吸取离心后的提取液2ml，对照管加蒸馏水2ml，然后各管再加入2ml0.6％硫代巴比妥酸溶液，摇匀，混合液在沸水浴中反应15min，迅速冷却后再离心。取上清液分别在532、600和450nm波长下测定吸光度值。mda计算：cmda＝6.45(a532-a600)-0.56a450(μmol·l^-1)。

5、冷害指数(cii)的测定

根据cao等人(euphytica,2015,205(2):569-584)的研究，确定了乌菜的耐寒性评分。有五种程度的冷害：0：乌菜叶子没有枯萎和萎缩现象；1：1～30％的叶片枯萎或萎缩；2：的叶片枯萎萎缩；3：60～90％的叶片枯萎；4：整个幼苗枯萎或死亡。冷害指数(cii)等于：cii＝σxa/(nσx)＝(x1a1+x2a2+...+xnan)/nt。具有相同冷害水平的幼苗数量由xn表示，并且a表示冷害程度。

三、各耐寒指标与piabs的相关性

1、净光合速率(a)与piabs的关系

在低温环境中生长的许多植物在生理、生态和形态上都表现出对胁迫的各种应对策略。光合作用可以反应植物对温度敏感度。并且了解低温下的光合适应机制对提高作物产量和可持续性至关重要。由图2可知，piabs高的基因型比piabs低的基因型能够获得更高的光合效率，并且证实piabs和净光合速率之间存在正相关关系。

2、电解质渗透率(ec)与piabs的关系

电解液渗透率是评价植物耐寒性的一种有效方法，选择合适的低温对于研究电解质渗透变化，准确反映植物耐寒性波动具有重要意义。在这项研究中，在20℃和5℃，ec和piabs呈现明显的负相关关系(图3)。

3、比叶面积(sla)与piabs的关系

以往有研究证明sla与光合作用呈显著正相关。piabs和sla在我们的研究中显示出显著的正相关性(图4)。

4、丙二醛含量(mda)与piabs的关系

在很多作物中证明过冷胁迫会显著提高叶片mda含量。在本研究中随着温度的降低乌菜叶片的mda增加，且与piabs呈负相关性(图5)。

5、冷害指数(cii)与piabs的关系

cii是最直接、最可靠，可以直接反映出冷害引起植物的损伤程度。当植物遭受胁迫时，生理变化首先对胁迫做出反应，然后在外观上观察到损伤。cii与piabs的相关性(图6)表明，较高piabs的乌菜基因型在寒冷条件下损伤较小。

6、表2为20种乌菜基因型在苗期梯度降温下20℃/15℃(d/n)、15/10℃(d/n)、15/10℃(d/n)、5℃/0℃(d/n)处理和成株期时fv/fm和piabs比较。

表2

上述指标在许多植物耐寒性研究中都得到过广泛的应用。本研究选择piabs与冷胁迫中广泛使用的几个指标之间的关系来提高准确性。以此证明光合性能指标piabs可以作为筛选乌菜耐寒性基因型的指标。

本研究以piabs为基础，从124个乌菜基因型中选取20个基因型(10个低piabs基因型和10个高piabs基因型)。在低温梯度条件下测定了这20种基因型的净光合速率、电解质渗透率、冷害指数、比叶面积、丙二醛含量，并证明了这些耐寒性指标和piabs的相关性。这些指标有力地证明了含有高piabs基因型的乌菜对冷胁迫的耐受性较高，低piabs的乌菜对冷害很敏感。因此，结合piabs方便测量的优点，piabs是可以作为乌菜耐寒性快速筛选的指标。