一种提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种利用生物反应器补料培养提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法。

背景技术：

东北刺人参(oplopanaxselatusnakai)，五加科，刺人参属，根较粗，侧根少，直立生长，枝上密生针状直刺，株高0.8-1.5米，呈淡灰黄色，单叶，互生，花白绿色，果实为红色，呈扁球形。在世界范围内，仅少量分布在中国、朝鲜、俄罗斯，在中国主要分布在吉林省长白山地区以及辽宁省东部，由于近年来全球气候变暖，东北刺人参的分布范围正在逐渐缩小，调查显示10年前长白山东北刺人参的面积在667hm²以上，株数可高达100万株，随着新药用价值的开发，对野生资源的利用量骤增，且远远超过了自然种群的更新能力，导致资源急剧枯竭，因此东北刺人参被国家列为“濒临灭绝”等级。

黄酮类化合物是东北刺人参中重要的次生代谢物之一，由于其分布范围广、具有多种药理活性，因此近年来对黄酮类化合物药物的开发成为热点。但是由于东北刺人参资源处于濒危状态，因此如何大规模生产东北刺人参中黄酮类物质成为一个重要问题。

植物生物反应器是利用植物组织器官或细胞生产包括抗体、药用蛋白或具有高药用价值的生物衍生品或生物制品。生物反应器具有自动化程度高、能实现周年生产、生产成本低、节省空间、产品质量稳定、经济效益高等优点，能为植物提供优良的物理和化学环境，从而提高植物体内次生代谢产物含量。

生物反应器培养可依培养液加入和产物的收集方式分为分批操作、连续操作和补料分批操作三种模式；但是传统实验室的分批操作可能会出现底物抑制、氧限制或新陈代谢过剩的问题；而连续操作是指反应底物连续稳定地加入反应器，同时反应物料也以相同流速连续稳定地从反应器流出，这种操作模式容易发生污染并且对于大规模的工业生产资金要求较高、操作人员技术要求也较高，仅适用于成熟的大规模工业生产；补料分批培养多应用于微生物领域，在植物中应用较少。

因此，提供一种利用生物反应器补料培养来提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法，是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种利用生物反应器补料培养来提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法，通过调节底物中营养物质的浓度，避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象，同时又可防止因某些营养成分耗尽而影响东北刺人参不定根的生长以及次级代谢产物黄酮的合成。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高东北刺人参不定根中黄酮含量的培养基，所述培养基为：1/2ms3l+3mg/liba+40g/l白糖，氮浓度为40mm，ph为5.8。

进一步，一种筛选提高东北刺人参不定根中黄酮含量的培养条件的方法，具体步骤如下：

(1)筛选初始培养基量和培养基浓度

取东北刺人参不定根20g，加入5l气球型气升式生物反应器中，温度为室温，采用3mg/liba+50g/l糖，将初始培养基分别设置为1/2ms2l、1/2ms3l、ms2l、ms3l，对照为ms4l，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；取干品测量黄酮含量，确定初始培养基量和培养基浓度为1/2ms3l；由于反应器为5l，因此允许的最大反应量为4l。

(2)筛选糖浓度

根据步骤(1)的结果，采用1/2ms3l+3mg/liba，将糖浓度分别设置为20g/l、30g/l、40g/l、对照为50g/l，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；取干品测量黄酮含量，确定糖浓度为40g/l；

(3)筛选氮浓度

根据步骤(2)的结果，采用1/2ms3l+3mg/liba+40g/l白糖，将氮浓度分别设置为20mm、30mm、40mm、50mm，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；取干品测量黄酮含量，确定氮浓度为40mm。

ms培养基中正常含氮量为60mm，其中硝酸钾浓度为1900mg/l，硝酸铵为1650mg/l；因此50mm氮浓度：硝酸钾浓度1583.33mg/l，硝酸铵为1375mg/l；40mm氮浓度：硝酸钾浓度1266.67mg/l，硝酸铵为1100mg/l；30mm氮浓度：硝酸钾浓度950mg/l，硝酸铵为825mg/l；20mm氮浓度：硝酸钾浓度633.33mg/l，硝酸铵为550mg/l。

进一步，所述通气为通入空气，生物反应器带有除菌功能，空气进入生物反应器则成为无菌空气。

进一步，所述脱水为采用离心机脱水。

进一步，一种提高东北刺人参不定根中黄酮含量的方法，具体步骤如下：取东北刺人参不定根20g，加入生物反应器中，采用1/2ms3l+3mg/liba+40g/l白糖，氮浓度为40mm，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干，取干品测量黄酮含量。

本发明的有益效果是：本发明将补料分批操作应用于植物培养，通过调节底物中营养物质的浓度，避免因某些营养成分初始浓度过高而出现的底物抑制现象，同时又可防止因某些营养成分耗尽而影响培养物的生长和产物的合成；本发明利用补料分批培养生产东北刺人参不定根，其黄酮含量为原来的2.9倍，为不定根作为一种新植物材料应用于相关产品研发和生产提供坚实的技术基础和理论依据。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明的标准曲线；

图2附图为本发明初始培养基对黄酮含量影响的结果图；

图3附图为本发明糖浓度对黄酮含量影响的结果图；

图4附图为本发明氮浓度对黄酮含量影响的结果图；

其中，图中字母表示在0.05水平上有显著性差异。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。

实施例1制作标准曲线

标准曲线的制作方法如下：用电子秤精密称取10mg的芦丁标准品，用75％乙醇定容至250ml，分别取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml芦丁标准液用75％乙醇定容至2ml，摇匀后在每个试管中添加0.3ml5％的nano2，静置6min后加入0.3ml10％的al(no3)3，摇匀静置6min，加入2mlnaoh，充分混匀后，在吸光度为510nm下测od值。

以得出的od值为纵坐标，分别为0、0.015、0.03、0.044、0.069、0.085、0.101、0.132；横坐标为芦丁标准品定容后浓度，分别为0、0.002、0.004、0.008、0.012、0.016、0.02、0.024mg/ml；绘制标准曲线，结果如图1所示，方程为y＝5.1559x+0.0041。

实施例2测量样品黄酮含量

黄酮含量测量方法如下：

用电子秤精密称取0.1g东北刺人参不定根干品，研磨后加入10ml75％乙醇溶液，在60℃水浴锅中加热3h后用10ml针管吸取液体，用70％的乙醇溶液定容至25ml，取0.05ml，用75％乙醇定容至2ml，摇匀后在每个试管中添加0.3ml5％的nano2，静置6min后加入0.3ml10％的al(no3)3，摇匀静置6min，加入2mlnaoh，充分混匀后，在吸光度为510nm下测od值。

将样品的od值带入方程，计算获得样品的浓度c。

样品黄酮总含量(mg/g)＝cvd/m＝c*1*25*40/0.1

式中：c为样品溶液浓度(mg/g)，v为样品溶液与标准曲线溶液体积比，d为稀释倍数，m为称取的东北刺人参不定根的干品质量。

实施例3

一种筛选提高东北刺人参不定根中黄酮含量的培养条件的方法，具体步骤如下：

(1)筛选初始培养基量和培养基浓度

取东北刺人参不定根20g，加入5l气球型气升式生物反应器中，温度为室温，采用3mg/liba+50g/l糖，将初始培养基分别设置为1/2ms2l、1/2ms3l、ms2l、ms3l，对照为ms4l，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；上述试验重复三次(记为试验1、试验2和试验3)，取干品，用于测量黄酮含量，结果如表1和图2所示(图2由表1的数据经graphpadprism软件处理得到)，在初始培养基量和培养基浓度为1/2ms3l的条件下，黄酮含量最高。

表1初始培养基对黄酮含量的影响

(2)筛选糖浓度

根据步骤(1)的结果，采用1/2ms3l+3mg/liba，将糖浓度分别设置为20g/l、30g/l、40g/l、对照为50g/l，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；上述试验重复三次(记为试验1、试验2和试验3)，取干品，用于测量黄酮含量，结果如表2和图3所示(图3由表2的数据经graphpadprism软件处理得到)，在糖浓度为40g/l的条件下，黄酮含量最高。

表2蔗糖浓度对黄酮含量的影响

(3)筛选氮浓度

根据步骤(2)的结果，采用1/2ms3l+3mg/liba+40g/l白糖，将氮浓度分别设置为20mm、30mm、40mm、50mm，ph为5.8，通气量为75ml/min；培养20天后，分别补加ms+3mg/liba+50g/l糖至4l，ph为5.8，通气量为75ml/min，继续培养20天后收获不定根，用清水清洗后脱水1min，烘干；上述试验重复三次(记为试验1、试验2和试验3)，取干品，用于测量黄酮含量，结果如表3和图4所示(图4由表3的数据经graphpadprism软件处理得到)，在氮浓度为40mm的条件下，黄酮含量最高。

表3氮浓度对黄酮含量的影响

由上述结果可知，采用1/2ms3l+3mg/liba+40g/l白糖，氮浓度为40mm，ph为5.8，通过调节生物反应器控制通气量为75ml/min；20天后补加ms1l+3mg/liba+50g/l白糖，ph为5.8，通气量为75ml/min的方案，可以明显提高东北刺人参不定根中的黄酮含量。

以步骤(1)筛选初始培养基量和培养基浓度中的ms4l测定的黄酮含量均值((62.08+70.47+73.25)/3)＝68.6mg/g)为对照，说明本发明利用补料分批培养生产的东北刺人参不定根的黄酮含量((203.3079+200.2584+201.3436)/3＝mg/g)为对照的2.9倍。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。