本发明涉及组织培养领域。更具体地说，本发明涉及一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法。
背景技术：
：紫茎(拉丁学名：stewartiasinensisrehd.etwils.)，属山茶科紫茎属多年生木本植物，为中国特有的残遗植物。为了保护这一濒危物种，不少研究者采用组织培养的方式获取紫茎组培苗，并取得了一定成果，但是，现有的紫茎组织培养在对外植体进行消毒时，一般是采用的传统的酒精升汞消毒法，由于升汞有剧毒，对操作人员和环境存在危害，且获得的紫茎组培苗的畸形率高，幼苗成活率低，还需进一步改进。技术实现要素：本发明的目的是提供一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，其通过酒精配合微电流的方式对紫茎的茎尖进行消毒，对操作人员和环境友好，且使获得的紫茎组培苗的畸形苗率低至0.9％，幼苗成活率高达97.5％。为了实现根据本发明的目的和其它优点，提供了一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，包括：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，于0.5-2ma的电流下处理20-30s，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得。优选的是，所述的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，还包括，不定芽诱导培养，具体为，将所述外植体切割成2-3mm的小段并转接到不定芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下培养20d，得不定芽，其中，所述不定芽诱导培养基为：ms+1.5-2.0mg/l6-ba+1.0-1.5mg/lga3+1.0-1.5mg/liba+0.5-1.0mg/l2,4-d。优选的是，所述的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，还包括，丛生芽诱导培养，具体为，将所述不定芽切割成带1-2个芽的小块并分别转接到丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养25d，得丛生芽，其中，所述增殖培养基为：ms+1.5-2.0mg/l6-ba+1.5-2.0mg/lga3+1.0-1.5mg/liba+10-15g/l蜂花粉提取液。优选的是，所述的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，还包括，生根培养，具体为，将所述丛生芽转接到生根培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养5d，再于22-26℃，光照强度1800lux，光照时间8h/d的条件下培养10d，最后于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养20d，得紫茎幼苗，其中，所述生根壮苗培养基为：1/2ms+1.5-2.0mg/liba+1.0-1.5mg/lnaa+0.3-0.5mg/l2,4-d+15-20g/l牡蛎壳粉。优选的是，所述的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，所述蜂花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为6-8％的蜂花粉和5‰的纤维素酶，并将其置于超声波提取器中，于功率460-500w，频率40-45khz，温度30-35℃下提取10-15min，再离心，取上清液，即得。优选的是，所述的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，所述牡蛎壳粉的制备方法为：将牡蛎壳用水洗净、沥干，将其于550-600℃下高温煅烧后，冷却，即得。本发明至少包括以下有益效果：第一、通过酒精配合微电流的方式对紫茎的茎尖进行消毒，其一方面可增强酒精的消毒效果，避免使用升汞，对操作人员和环境友好，另一方面降低因消毒不当导致的紫茎茎尖损伤，降低紫茎组培苗的畸形率；第二、通过在丛生芽诱导培养基中添加蜂花粉提取液，其富含的氨基酸、维生素、微量元素、活性酶和芸苔素等活性成分，将蜂花粉提取液与6-ba、ga3和iba配合，可有效促进紫茎细胞的增殖、扩大、分裂和分化，提高丛生芽的增殖系数；第三、通过在生根培养基中添加牡蛎壳粉，牡蛎壳粉为疏松多孔结构，并富含矿物活性成分，将牡蛎壳粉与iba、naa和2,4-d相配合，牡蛎壳粉可作为缓释载体，使得ba、naa和2,4-d缓慢释放，促使丛生芽基部的细胞分裂、诱导生根，并使根系健壮；第四、本发明的使用茎尖快速繁殖紫茎的方法可有效提高紫茎的增殖系数，达5.3-5.5倍，畸形苗率低至0.9％，幼苗成活率高达97.5％，有效解决了紫茎自然繁殖困难的问题，为紫茎的保护提供了一种新的路径。本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。具体实施方式下面结合实施例对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。需要说明的是，下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。实施例1：一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，包括：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，于0.5ma的电流下处理30s，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得。不定芽诱导培养，具体为，将所述外植体切割成2-3mm的小段并转接到不定芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下培养20d，得不定芽，其中，所述不定芽诱导培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+1.0mg/lga3+1.0mg/liba+0.5mg/l2,4-d。丛生芽诱导培养，具体为，将所述不定芽切割成带1-2个芽的小块并分别转接到丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养25d，得丛生芽，其中，所述增殖培养基为：ms+1.5mg/l6-ba+1.5mg/lga3+1.0mg/liba+10g/l蜂花粉提取液。生根培养，具体为，将所述丛生芽转接到生根培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养5d，再于22-26℃，光照强度1800lux，光照时间8h/d的条件下培养10d，最后于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养20d，得紫茎幼苗，其中，所述生根壮苗培养基为：1/2ms+1.5mg/liba+1.0mg/lnaa+0.3mg/l2,4-d+15g/l牡蛎壳粉。其中，所述蜂花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为6％的蜂花粉和5‰的纤维素酶，并将其置于超声波提取器中，于功率460w，频率40khz，温度30-35℃下提取10min，再离心，取上清液，即得；所述牡蛎壳粉的制备方法为：将牡蛎壳用水洗净、沥干，将其于550℃下高温煅烧后，冷却，即得。实施例2：一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，包括：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，于1ma的电流下处理25s，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得。不定芽诱导培养，具体为，将所述外植体切割成2-3mm的小段并转接到不定芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下培养20d，得不定芽，其中，所述不定芽诱导培养基为：ms+1.8mg/l6-ba+1.2mg/lga3+1.2mg/liba+0.8mg/l2,4-d。丛生芽诱导培养，具体为，将所述不定芽切割成带1-2个芽的小块并分别转接到丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养25d，得丛生芽，其中，所述增殖培养基为：ms+1.8mg/l6-ba+1.8mg/lga3+1.3mg/liba+12g/l蜂花粉提取液。生根培养，具体为，将所述丛生芽转接到生根培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养5d，再于22-26℃，光照强度1800lux，光照时间8h/d的条件下培养10d，最后于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养20d，得紫茎幼苗，其中，所述生根壮苗培养基为：1/2ms+1.8mg/liba+1.2mg/lnaa+0.4mg/l2,4-d+18g/l牡蛎壳粉。其中，所述蜂花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为7％的蜂花粉和5‰的纤维素酶，并将其置于超声波提取器中，于功率480w，频率43khz，温度30-35℃下提取13min，再离心，取上清液，即得；所述牡蛎壳粉的制备方法为：将牡蛎壳用水洗净、沥干，将其于580℃下高温煅烧后，冷却，即得。实施例3：一种使用茎尖快速繁殖紫茎的方法，包括：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，于2ma的电流下处理20s，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得。不定芽诱导培养，具体为，将所述外植体切割成2-3mm的小段并转接到不定芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下培养20d，得不定芽，其中，所述不定芽诱导培养基为：ms+2.0mg/l6-ba+1.5mg/lga3+1.5mg/liba+1.0mg/l2,4-d。丛生芽诱导培养，具体为，将所述不定芽切割成带1-2个芽的小块并分别转接到丛生芽诱导培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养2d，再于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养25d，得丛生芽，其中，所述增殖培养基为：ms+2.0mg/l6-ba+2.0mg/lga3+1.5mg/liba+15g/l蜂花粉提取液。生根培养，具体为，将所述丛生芽转接到生根培养基中，先于22-26℃，黑暗条件下培养5d，再于22-26℃，光照强度1800lux，光照时间8h/d的条件下培养10d，最后于25-28℃，光照强度2500-2800lux，光照时间12h/d的条件下继续培养20d，得紫茎幼苗，其中，所述生根壮苗培养基为：1/2ms+2.0mg/liba+1.5mg/lnaa+0.5mg/l2,4-d+20g/l牡蛎壳粉。其中，所述蜂花粉提取液的制备方法为：向水中加入质量分数为8％的蜂花粉和5‰的纤维素酶，并将其置于超声波提取器中，于功率500w，频率45khz，温度30-35℃下提取15min，再离心，取上清液，即得；所述牡蛎壳粉的制备方法为：将牡蛎壳用水洗净、沥干，将其于600℃下高温煅烧后，冷却，即得。对比例1：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，处理1min，取出，用无菌水冲洗2-3次，再将其放入质量浓度为0.1％的升汞溶液中，处理5min，最后用无菌水冲洗5-6次，即得，其余操作条件同实施例2。对比例2：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，处理2min，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得，其余操作条件同实施例2。对比例3：紫茎的外植体制备，其具体为：剪取紫茎幼嫩的茎尖，将所述茎尖用质量分数为2％的洗洁精水溶液浸泡30min，取出，用流水冲洗10-15min，然后将其放入质量分数为70％的酒精溶液中，于3ma的电流下处理25s，取出，用无菌水冲洗2-3次，即得，其余操作条件同实施例2。对比例4：在实施例2的基础上，丛生芽诱导培养不添加蜂花粉提取液，其余操作条件同实施例2。对比例5：在实施例2的基础上，生根培养基中的牡蛎壳粉替换为活性炭粉，其余操作条件同实施例2。统计实施例2和各对比例的增殖系数、畸形苗率和幼苗成活率，结果见下表。组别增殖系数(倍)畸形苗率(％)幼苗成活率(％)实施例25.50.997.5对比例12.250.866.4对比例23.428.670.1对比例31.870.758.0对比例43.91.096.4对比例55.21.290.5对比例2的组织培养过程中存在细菌污染，单纯的酒精消毒不能使外植体杀菌彻底；对比例3增殖系数最低，畸形苗率最高，可能是微电流处理过度，损害了紫茎茎尖；对比例5所得紫茎幼苗的根系均不如实施例2所得紫茎幼苗的根系健壮，对后期移栽成活率的影响还有待实验。尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。当前第1页12