山草果的组织培养快速繁殖方法与流程

本发明属于香料植物组培
技术领域：
，涉及一种山草果的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
：山草果又叫贯叶马兜铃，山胡椒，山蔓草(学名:aristolochiadelavayi)，是马兜铃目马兜铃科的多年生攀援草本植物，生长于海拔1600-1900米的石灰岩山地、丘陵或河谷灌木丛中，土层瘠薄、多砾石的红壤地带，是一种云南独特的野生食用香料植物，它对去除牛、羊、鱼、猪、狗等肉食的腥、膻气味非常好的效果、更能增加食品的香气和风味，同时也具有健胃增进食欲、宣肺止咳等作用和功效。近年来，随着经济的发展和人民生活水平的提高，加大了畜牧业的发展，当地人民大量的釆挖，野生资源面临灭绝，早在1989年云南省政府发布的111号交件《云南省第一批重点保护野生植物名录》中，野生山草果被列为国家一级保护野生濒危植物，列入《世界自然保护联盟》，由于该物种生长环境适应范围的局限性，以及种子结实率低，不易获得种子等原因。如果没有有效的保护措施，该物种将陷入灭绝之境地，严重影响山草果的可持续开发和利用，为保障山草果原料来源，种苗问题已成为限制山草果人工大面积推广种植的瓶颈，因此，利用植物组织培养方法，可大量快速繁殖山草果优质、优良种苗，对山草果资源的利用、保护及人工规模化、集约化种植具有重要意义。技术实现要素：为实现上述目的，本发明提供一种山草果的组织培养快速繁殖方法，解决了现有技术中种子结实率低，不易获得种苗的问题。本发明所采用的技术方案是，山草果的组织培养快速繁殖方法，具体按照以下步骤进行：步骤一、外植体的选择：每年4-5月，选取生长健壮、无病虫害山果草植株嫩叶；步骤二、外植体灭菌：外植体在自来水下冲冼干净，用质量分数为0.02％的高锰酸钾溶液浸泡10分钟，再用自来水冲洗干净，然后在无菌工作台内用质量分数为0.1％的升汞溶液灭菌5分钟，用无菌水冲洗5-6次，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分；将无菌叶片切割为1cm2小块；步骤三、愈伤组织诱导培养：将步骤二得到的1cm2小块的无菌叶片，接种到培养基中，培养基为ms培养基+6-ba0.2-0.5mg/l+2.4d0.2mg/l/naa0.1-0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，愈伤组织诱导培养基ph值为6.0，叶片叶面接触培养基，在叶脉处划伤叶脉，在温度为23-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为每天10小时的条件下培养25-30天，得到愈伤组织；步骤四、不定芽诱导分化培养：将步骤三得到的愈伤组织切割成小块，接种到培养基中，培养基为ms培养基+6-ba0.2-1mg/l+naa0.1-0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值为5.8-6.2；在温度23-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为每天10小时的条件下，培养20-25天得到不定芽丛；步骤五、增殖培养：将步骤四得到的芽丛切割成1-2个小芽的芽丛或含1-2个茎节的小段，接种到培养基中，培养基为ms培养基+6-ba0.2-0.8mg/l+丝氨酸0-0.4mg/l+naa0.1-0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值为5.8-6.2；在温度23-25℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为每天12小时的条件下，培养15-20天，得到不定芽丛；步骤六、生根培养：将步骤五得到的不定芽丛，从叶痕下0.5cm的地方切段并带少量愈伤组织的小苗，接种到ms培养基+iba0.6mg/l+naa0.3mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2的培养基中，在温度23-25℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为每天10小时的条件下，培养30-40天，得到生根苗；步骤七、驯化和炼苗：将步骤六得到的小苗，用清水洗净生根苗基部的培养基，然后定植到基质中，浇足定根水，保持湿度为70-80％，遮光率为40％，7天后增加光照，中午12时以前拉开遮阳网，中午12时后关闭遮阳网，湿度控制在50-60％，15-20天后，按照自然条件管理，除冬季，其他季节都能够驯化炼苗，经30-40天的驯化炼苗。进一步的，所述步骤三愈伤组织诱导培养基为ms培养基+6-ba0.2mg/l+2.4-d0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.0。进一步的，所述步骤四中将步骤三得到的愈伤组织切割成长0.5cm、宽0.5cm的小块。进一步的，所述步骤四不定芽的诱导培养基为ms培养基+6-ba0.3mg/l+naa0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2。进一步的，所述步骤五继代增殖培养的培养基为ms培养基+6-ba0.2mg/l+丝氨酸0.4mg/l+naa0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2。进一步的，所述步骤六中不定芽丛，从叶痕下0.5cm的地方切段并带少量愈伤组织，切割成1.5-2.0cm长，含2叶1心的小苗，生根培养基为ms培养基+iba0.6mg/l+naa0.3mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2。进一步的，所述步骤七定根水为稀释2000倍的质量分数为70％的甲基托布津溶液。进一步的，所述步骤七自制的基质按照质量份数由3份珍珠岩和7份稻壳灰组成。本发明的有益效果是，与现有技术相比，提供一种山草果的组织培养快速繁殖方法，以山草果嫩叶为外植体，经叶片愈伤组织诱导；愈伤组织不定芽分化，增殖培养以及生根培养4个过程来实现山草果的组培快繁工厂化生产。解决了山草果在组培过程中，外植体灭菌难，易褐化，生长慢，不易快速获得无牲繁殖体系以及易产生玻璃化、畸形苗等实际问题，以满足山草果优质种苗的大规模生产需要。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是山果草不定芽诱导分化图；图2是山果草增殖培养图；图3是山果草生根苗根系生长图。具体实施方式下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。山草果的组织培养快速繁殖方法，具体按照以下步骤进行：步骤一、外植体的选择：每年4-5月，选取生长健壮、无病虫害山果草植株嫩叶；步骤二、外植体灭菌：外植体在自来水下冲冼干净，用质量分数为0.02％的高锰酸钾溶液浸泡10分钟，再用自来水冲洗干净，然后在无菌工作台内用质量分数为0.1％的升汞溶液灭菌5分钟，用无菌水冲洗5-6次，最后用无菌滤纸吸去外植体表面水分；将无菌叶片切割为1cm2小块；步骤三、愈伤组织诱导培养：将步骤二得到的1cm2小块的无菌叶片，分别接种到培养基1、培养基2和培养基3中，培养基1为ms培养基+6-ba0.2mg/l+2.4d0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l；培养基2为ms培养基+6-ba0.2mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l；培养基3为ms培养基+6-ba0.5mg/l+naa0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，3种愈伤组织诱导培养基ph值均为6.0，叶片叶面接触培养基，并用手术刀在叶脉处划伤叶脉，有利于愈伤组织的产生，在温度为23-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为每天10小时的条件下培养25-30天，得到愈伤组织，不同培养基对愈伤组织的影响情况如表1所示；1-3号培养基均能产生愈伤组织，其中1号培养基更有利益愈伤组织的生长，愈伤组织分化最早，生长最快，7-10天开始出现愈伤组织，25-30天愈伤组织大小达2cm2；表1不同的培养基对愈伤组织诱导培养的影响培养基培养基1培养基2培养基3愈伤组织出现时间7-10天15-20天12-15天愈伤组织大小(25-30天)2cm20.8cm21.5cm2步骤四、不定芽诱导分化培养：将步骤三得到的愈伤组织切割成长0.5cm、宽0.5cm的小块，分别接种到培养基4、培养基5、培养基6和培养基7中，培养基4为ms培养基+6-ba0.3mg/l+naa0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值为6.2；培养基5为ms培养基+6-ba1mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2；培养基6为ms培养基+6-ba0.2mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值5.8；培养基7为ms培养基+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值5.8；在温度23-25℃，光照强度为1800-2000lx，光照时间为每天10小时的条件下，培养20-25天得到不定芽丛，其中培养基4，不定芽分化最好，10天分化出不定芽，不定芽生长快，芽丛长势最好，芽粗壮，整齐，不定芽分化数量适中，每块愈伤组织平均分化不定芽10个，不同的培养基对不定芽诱导分化的影响，如表2所示，山果草不定芽诱导图如图1所示；表2不同的培养基对不定芽诱导分化培养的影响步骤五、增殖培养：将步骤四得到的芽丛切割成1-2个小芽的芽丛或含1-2个茎节的小段，分别接种到8-11培养基中，培养基8为ms培养基+6-ba0.2mg/l+丝氨酸0.4mg/l+naa0.1mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2；培养基9为ms培养基+6-ba0.2mg/l+丝氨酸0.2mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值5.8；培养基10为ms培养基+6-ba0.8mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2；培养基11为ms培养基+6-ba0.5mg/l+naa0.2mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值5.8，在温度23-25℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为每天12小时的条件下，培养15-20天，得到不定芽丛，实现不定芽的大量增殖、扩繁；其中，培养基8的培养效果最好，芽丛粗壮，生长快，长势好，无玻璃化现象，在不定芽的增殖、继代培养中，丝氨酸和6-ba的配合使用，在确保相同增殖倍数的同时，降低6-ba的使用量，进一步提高不定芽的分化质量，减少了玻璃化现象和畸形苗的产生，山果草增殖培养图如图2所示；表3不同的培养基对增殖培养的影响步骤六、生根培养：将步骤五得到的不定芽丛，从叶痕下0.5cm的地方切段并带少量愈伤组织，切割成1.5-2.0cm长，含2叶1心的小苗，接种到ms培养基+iba0.6mg/l+naa0.3mg/l+糖30g/l+琼脂5g/l，ph值6.2的培养基中，在温度23-25℃，光照强度为2000-2500lx，光照时间为每天10小时的条件下，培养30-40天，得到生根苗，生根率达75％，山果草生根培养图如图3所示；步骤七、驯化和炼苗：将步骤六得到的小苗，用清水洗净生根苗基部的培养基，将质量分数为70％的甲基托布津溶液稀释2000倍液作为定根水，然后定植到按照质量份数由3份珍珠岩和7份稻壳灰组成的基质中，浇足定根水，保持湿度为70-80％，遮光率为40％，7天后增加光照，中午12时以前拉开遮阳网，中午12时后关闭遮阳网，湿度控制在50-60％，15-20天后，按照自然条件管理，除冬季，其他季节都能够驯化炼苗，经30-40天的驯化炼苗，成活率达62％。稻壳灰为水稻谷壳烧成的灰，质轻、透气，吸湿性适中，高温炭化不带病菌，珍珠岩吸水性强，保水性好，珍珠岩和稻壳灰按3:7的比例混合，水份适中，即保水又透气。本发明利用山草果叶片容易产生愈伤组织的特点，以叶片为诱导材料，有效解决了以茎尖或茎段作外植体时，灭菌难、易褐化、易杀死、污染率高、诱导时间长、诱导分化率低等技术问题；愈伤组织诱导分化率和不定芽诱导分化率均达100％，分化时间短，经20-25天的培养可获得大量的不定芽丛；增加光照时间，加强光照，降低培养室的温度，可进一步解决易褐化的问题；同时，在培养基中加入丝氨酸，在不影响不定芽分化的增殖的情况下，降低了激素(6-ba)的使用量，进一步解决了玻璃化，褐化和畸形苗等问题；能使种苗性状更稳定，适宜标准化、规模化生产、更易产生壮苗，炼苗成活率可达62％以上，为市场提供标准统一的优质、优良种苗。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围内。当前第1页12