一种毛白杨组培方法与流程

本发明属于植物组织培养技术领域，具体涉及一种毛白杨的组培方法。

背景技术：

植物组织培养技术依据的是细胞的全能性，指在无菌条件下，将离体的植物器官、组织、细胞以及原生质体，培养在人工培养基上给予适宜的环境条件，诱发产生愈伤组织、潜伏芽等，进而培育成完整植株的技术。近年来，植物组织培养技术成为了植物育种、植物脱毒和快速繁育、植物次生代谢产物生产、植物种质资源保存等方面的研究的核心技术，培育出了大面积种植的植物新品种。目前，植物组织培养技术已经在农业、林业、牧业、等多个领域有了广泛的应用，组培快繁技术能够不受季节等条件的限制，具有生长周期短、繁殖速度快和苗木整齐一致、能够周年生产等优点。如在林业方面，泡桐、毛白杨、杉木等已投入工厂化快繁，极大地提高了产量及品质的改善，使组培苗生产在国际国内市场形成产业化，获取了极佳的经济效益。

毛白杨(populustomentosa)是杨柳科杨属落叶大乔木，树干直挺，枝叶茂密，适应性强，是我国北方的重要速生树种，广泛用于工业用材和城市绿化。然而在苗木生产上毛白杨通常以扦插、压条等无性繁殖方法进行繁殖，很难生根，加之繁殖材料有限，不仅耗材多、费工费时，而且成活率低，繁殖系数小，在短期内繁殖大量苗木会十分困难。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种毛白杨组培方法，适用于不同基因型、不同成熟度的毛白杨外植体，可在短时间内获得大量毛白杨苗木，成活率高，繁殖系数高。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种毛白杨组培方法，包括以下步骤：

1)以毛白杨组织为外植体，将所述外植体接种于诱导增殖培养基上进行诱导增殖培养，得增殖芽；所述诱导增殖培养采用诱导增殖培养基s1进行，所述诱导增殖培养基s1以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2mg/l的6-ba，0.1mg/l的iba，24～35g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂；所述诱导增殖培养的温度为(22±5)℃，光照强度为1000～5000lx，光照时间为12h/d；

2)将所述增殖芽接种于诱导生根培养基上进行诱导生根培养，得毛白杨组培苗；所述诱导生根培养采用诱导生根培养基r1进行，所述诱导生根培养基r1以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.3mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂；所述诱导生根培养的温度为(22±5)℃，光照强度为1000～5000lx，光照时间为12h/d。

优选的，所述外植体包括一年生枝条或将直径≤3cm枝条水培后长出的嫩枝。

优选的，当所述外植体为用古树枝条水培得到的嫩枝时，在用诱导增殖培养基s1进行诱导增殖培养前，还包括利用诱导增殖培养基s2进行分化芽培养；所述所述诱导增殖培养基s2以ms为基本培养基，还包括：0.15mg/l的6-ba，0.1mg/l的iba，15g/l的蔗糖和5.8g/l的琼脂。

优选的，当利用所述诱导增殖培养基s2只能得到绿色团状愈伤组织时，将所述毛白杨外植体接种于诱导增殖培养基s3上培养得到分化芽，再将所述分化芽接种于诱导增殖培养基s1上培养，得增殖芽；所述诱导增殖培养基s3以ms为基本培养基，还包括：30g/l的蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值为5.8～6.2。

优选的，在用诱导生根培养基r1进行诱导生根培养后，得到生根率低、但株高、叶片大小生长正常的所述毛白杨组培苗时，还包括利用诱导生根培养基r2进行生根培养；所述诱导生根培养基r2以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.7mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。

优选的，在所述诱导生根培养15d后，进行所述生根培养。

优选的，在用诱导生根培养基r1进行诱导生根培养后，得到生根率低、株高增长缓慢的所述毛白杨组培苗时，还包括利用诱导生根培养基r3进行培养；所述诱导生根培养基r3以1/2ms培养基为基本培养基，还包括10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。

优选的，在所述诱导生根培养15d后，进行所述培养。

本发明提供了一种毛白杨的组培方法，包括外植体分化增殖成增殖芽，增殖芽诱导生根得组培苗两个连续过程，简化了初代培养过程；可针对不同来源、不同成熟度的外植体，在本发明实施例中，分别采用了全国毛白杨种质资源库随机选择的基因型及毛白杨古树(树龄约300年)进行组培，均可得到健壮的组培苗，其在短时间内容易成功获得大量组培苗，操作简便，繁殖系数高。

附图说明

图1为本发明实施例1不定芽诱导图；

图2为本发明实施例2不定芽诱导图；

图3为本发明实施例3生根诱导及长势图；

图4为本发明实施例4生根诱导及长势图；

图5为本发明实施例5生根诱导及长势图。

具体实施方式

本发明提供了一种毛白杨组培方法，包括以下步骤：1)以毛白杨组织为外植体，将所述外植体接种于诱导增殖培养基上进行诱导增殖培养，得增殖芽；所述诱导增殖培养采用诱导增殖培养基s1进行，所述诱导增殖培养基s1以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2mg/l的6-ba，0.1mg/l的iba，24～35g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂；所述诱导增殖培养的温度为(22±5)℃，光照强度为1000～5000lx，光照时间为12h/d；

2)将所述增殖芽接种于诱导生根培养基上进行诱导生根培养，得毛白杨组培苗；所述诱导生根培养采用诱导生根培养基r1进行，所述诱导生根培养基r1以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.3mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂；所述诱导生根培养的温度为(22±5)℃，光照强度为1000～5000lx，光照时间为12h/d。

在本发明的所述毛白杨组培方法中，所述外植体的种类优选包括一年生枝条或将直径≤3cm枝条水培后长出的嫩枝。在本发明中，所述外植体可来源于0～300年生的毛白杨树，当所述外植体来源于古树时，优选以其上的一年生枝条或将直径≤3cm枝条水培后长出的嫩枝作为外植体。本发明对所述枝条水培的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规方法即可。本发明所述外植体在进行诱导增殖培养前，优选包括消毒，本发明对所述消毒的方法并没有特殊限定，利用本领域的常规消毒方法即可。

本发明所述诱导增殖培养基s1以ms培养基为基本培养基，还包括：0.2mg/l的6-ba，0.1mg/l的iba，24～35g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。本发明所述诱导增殖培养基s1中蔗糖的浓度优选为26～33g/l，更优选为28～32g/l，最优选为30g/l。本发明所述诱导培养基s1中琼脂的浓度优选为5～8g/l，更优选为5.5～6.5g/l，最优选为5.8g/l。本发明所述诱导增殖培养基s1的ph值优选为5.8～6.2。本发明所述诱导增殖培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述诱导增殖培养的光照强度优选为1000～5000lx，更优选为1500～4000lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述诱导增殖培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述诱导增殖培养的时间优选为25d。

在本发明中，当所述外植体为用古树枝条水培得到的嫩枝时，在用诱导增殖培养基s1进行诱导增殖培养前，优选还包括利用诱导增殖培养基s2进行分化芽培养；所述所述诱导增殖培养基s2以ms为基本培养基，还包括：0.15mg/l的6-ba，0.1mg/l的iba，15g/l的蔗糖和5.8g/l的琼脂。本发明在所述诱导增殖培养基s2上培养15d可得到分化芽，所述分化芽在诱导增殖培养基s1上培养25d可得到增殖芽。本发明所述分化芽培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述分化芽培养的光照强度优选为1000～5000lx，更优选为1500～4500lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述分化芽培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述分化芽培养的时间优选为30d。

在本发明中，当利用所述诱导增殖培养基s2只能得到绿色团状愈伤组织时，优选将该基因型毛白杨外植体接种于诱导增殖培养基s3上培养得到分化芽，再将所述分化芽接种于诱导增殖培养基s1上培养，得增殖芽；所述诱导增殖培养基s3以ms为基本培养基，还包括：30g/l的蔗糖和5.8g/l的琼脂，ph值为5.8～6.2。本发明在所述诱导增殖培养基s2上培养15d可得到愈伤组织，所述愈伤组织在诱导增殖培养基s3上培养30d可得到分化芽，将所述分化芽在诱导增殖培养基s1上培养25d可得到增殖芽。本发明所述培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述培养的光照强度优选为1000～5000lx，更优选为1500～4500lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述培养的时间优选为30d。

得增殖芽后，本发明将所述增殖芽接种于诱导生根培养基上进行诱导生根培养，得毛白杨组培苗；所述诱导生根培养以诱导生根培养基r1进行，所述诱导生根培养基r1以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.3mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂；所述诱导生根培养的温度为(23±2)℃，光照强度为1000～5000lx，光照时间为12h/d。

本发明中所述生根培养基r1以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.3mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。本发明所述生根诱导培养基r1中蔗糖的浓度优选为12～18g/l，更优选为14～16g/l，最优选为15g/l。本发明所述生根诱导培养基r1中琼脂的浓度优选为5～8g/l，更优选为5.5～6.5g/l，最优选为5.8g/l。本发明所述诱导生根培养基r1的ph值优选为5.8～6.2。本发明所述诱导生根培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述诱导生根培养的光照强度优选为1500～4500lx，更优选为1800～3500lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述诱导生根培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述诱导生根培养的时间优选为25d。

在本发明中，当用所述诱导生根培养基r1进行诱导生根培养后，得到根量少、生长正常的所述毛白杨组培苗时，优选还包括利用诱导生根培养基r2进行生根培养；所述诱导生根培养基r2以1/2ms培养基为基本培养基，还包括0.7mg/l的iba，10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。本发明在所述诱导生根培养基r1上诱导生根培养15d后，可得到少量根且植株发育正常的毛白杨组培苗。本发明所述生根诱导培养基r2中蔗糖的浓度优选为12～18g/l，更优选为14～16g/l，最优选为15g/l。本发明所述生根诱导培养基r2中琼脂的浓度优选为5～8g/l，更优选为5.5～6.5g/l，最优选为5.8g/l。本发明所述诱导生根培养基r2的ph值优选为5.8～6.2。本发明所述生根培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述生根培养的光照强度优选为1000～5000lx，更优选为1500～4500lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述生根培养的光照时间优选为12h/d。本发明所述生根培养的时间优选为25～35d。

在本发明中，当在用诱导生根培养基r1进行诱导生根培养后，得到根量少、生长缓慢的所述毛白杨组培苗时，优选还包括利用诱导生根培养基r3进行培养；所述诱导生根培养基r3以1/2ms培养基为基本培养基，还包括10～20g/l的蔗糖和4.5～8.6g/l的琼脂。本发明优选在所述诱导生根培养15d后，进行所述培养。本发明所述生根诱导培养基r3中蔗糖的浓度优选为12～18g/l，更优选为14～16g/l，最优选为15g/l。本发明所述生根诱导培养基r3中琼脂的浓度优选为5～8g/l，更优选为5.5～6.5g/l，最优选为5.8g/l。本发明所述诱导生根培养基r3的ph值优选为5.8～6.2。本发明所述培养的温度优选为(22±4)℃，更优选为(23±2)℃。本发明所述培养的光照强度优选为1000～5000lx，更优选为1500～4500lx，最优选为2000～3000lx。本发明所述培养的光照时间优选为12h/d。

下面结合实施例对本发明提供的毛白杨的组培方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

利用s1培养基对‘毅杨1号’(良种编号国s-sv-py-001-2013)、‘毅杨3号’(良种编号国s-sv-py-003-2013)进行不定芽诱导，不定芽分化增殖效果良好，如图1所示，其中1-1为毅杨1号诱导得到不定芽(诱导率95％)，1-2为毅杨3号诱导得到不定芽(诱导率98％)。

实施例2

对老化毛白杨材料进行不定芽增殖诱导，利用s2培养基对树龄约300年材料老化严重的古树毛白杨ts-1进行不定芽诱导，经过25d诱导，无分化芽，且伴有淡绿色团状愈伤组织出现。由此将s2更换为s3培养基后，30d后不定芽分化正常，且无玻璃化现象。诱导结果如图2所示，其中2-1为经s2诱导得到的愈伤组织(不定芽诱导率0％)，2-2为经s3诱导后得到的不定芽(不定芽诱导率90％)。

实施例3

利用r2培养基对‘毅杨1号’(良种编号国s-sv-py-001-2013)、‘毅杨3号’(良种编号国s-sv-py-003-2013)进行生根诱导。经过25d培养，观察生根情况，生根正常，且组培苗生长良好。诱导结果如图3所示，其中3-1为r2对毅杨1号的生根诱导(生根率92.3％)，3-2为r2对毅杨3号的生根诱导(生根率88.7％)。

实施例4

分别采用r1、r2培养基对北京种源的林源1号(品种号20160192)进行生根诱导。利用r1培养基对林源1号增殖芽进行生根诱导，25d后发现组培苗株高增长正常、叶片状态良好，但生根率低(生根率为30％)。由此将培养基r1更换为r2，25d后林源1号生根正常，组培苗生长状态良好。诱导结果如图4所示，其中4-1为r1对林源1号的生根诱导，4-2为r1培养基下林源1号的生长状态，4-3为r2对林源1号的生根诱导(生根率达88.5％)。

实施例5

分别采用r1、r2培养基对景林1号(品种号20160186)进行生根诱导。利用r1培养基对景林1号增殖芽进行生根诱导，25d后发现组培苗株高增长异常(矮化)，但生根良好(生根率85％)。由此将培养基r1更换为r3，25d后景林1号生根正常，且株高增长明显，组培苗生长状态良好。诱导结果如图5所示，其中5-1为对景林1号的生根诱导，5-2为r1培养基下景林1号的生长状态，5-3为r3对景林1号的生根诱导(生根率为90％)。

本发明提供了一种毛白杨组培方法，所述方法不包括传统意义的初代培养，而是直接将外植体材料在消毒后按照材料老化程度直接接种于添加激素的s1或s2进行培养，诱导不定芽产生增殖芽，从而进行生根培养，方案简单，组培效率高，外植体分化芽诱导率达90％，生根诱导率达88.5％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。