一种滑石基质爪哇虫草孢子制剂的制作方法

本发明属于生物防治
技术领域：
。更具体地，涉及一种滑石基质爪哇虫草孢子制剂。
背景技术：
：烟粉虱(bemisiatabaci(gennadius))和柑橘木虱(diaphorinacitrikuwayama)等虫害给农业果业造成了严重的损失，而由于长期使用化学农药，害虫天敌消失，对常规杀虫剂抗药性增加，以及化学农药对人类和生态环境的影响，促成了世界各国有关限制化学农药应用法规的产生。这些法规不仅使许多化学杀虫剂无法使用，而且极大地增加新型杀虫剂的开发成本，从而使人们对害虫防治的生物学手段更加感兴趣。在对农业害虫的综合防控中，生物防治因其绿色、环保、持效等优点成为最有效和最具应用前景的防治手段，生物防治是利用有益生物及其产物控制有害生物种群的防治技术，生物防治主要是通过利用生物之间相互依存、相互制约的食物链，使生物间的动态平衡向有利于农业生产方向倾斜。因此，寻求有效的生物防治产品及应用技术是今后害虫可持续控制的主要研究方向之一。目前，在市场销售的害虫毒杀剂，并在实践中已单独或混配使用的有机氯、有机磷、有机汞、有机砷，拟除虫菌酯类的杀虫剂，这些农药在药品分级中属高毒或剧毒高残留蓄积药品，人们在实际操作中，造成人畜中毒死亡，对人们生命安全、国家的财产造成严重的损失。为了防止和控制害虫的损害，非常需要开发出一种新型高效的微生物杀虫制剂。然而，要得到一种高效且对人畜安全环境无污染的微生物杀虫剂，至今在市场还是少见的。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服现有烟粉虱和柑橘木虱等农业害虫防治方法的的缺陷和不足，提供一种以菌治虫的微生物杀虫剂，特别是指一种灭治烟粉虱和柑橘木虱等农业害虫的微生物杀虫制剂，可有效地控制和杀灭目标害虫。本发明的目的是提供一种滑石基质爪哇虫草孢子制剂。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种滑石基质爪哇虫草孢子制剂，是由爪哇虫草(cordycepsjavanica)、蜜糖、酵母、无菌水、纤维素、吐温-80、滑石粉组成的混合物。优选地，所述爪哇虫草为爪哇虫草菌株gzq-1，于2018年8月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：gdmccno：60437。该滑石基质爪哇虫草孢子制剂是一种以菌治虫的活体微生物杀虫药剂，配方中含有蜜糖、酵母、无菌水，它们既是配料中的良好培养基，又是引诱剂，纤维素使制剂中孢子保存时间更持久，滑石粉、吐温-80作为添加剂，有利于孢子的萌发。配方中的虫生真菌微生物杀虫剂的爪哇虫草，是真菌杀虫剂，是一种能使昆虫致病的真菌。配方中爪哇虫草的分生孢子成熟以后，能在空气中自由漂浮，当空气湿度较大时，很容易黏附在昆虫的体表，在适宜的温度和湿度条件下，孢子吸水膨胀萌发出菌丝。昆虫体表硬壳的主要成分是几丁质，而爪哇虫草的菌丝恰恰能分泌出几丁质酶，这种酶专门溶解几丁质，它们主要靠酶的作用，先把昆虫坚硬的外骨骼钻出一个洞，于外角质层进入血腔，随后吸取营养并产生免疫抑制毒素，破坏宿主细胞，导致寄主死亡。寄主死后真菌从尸体角质层长出释放分生孢子并感染其他寄主。另外优选地，所述滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.1～1％、蜜糖0.5～5.0％、酵母0.05～0.5％、无菌水25～55％、纤维素0.1～1％、吐温-800.5～2.0％、滑石粉50～80％。更优选地，所述滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.4～0.6％、蜜糖2.0～4.0％、酵母0.4～0.6％、无菌水35～45％、纤维素0.4～0.6％、吐温-800.8～1.2％、滑石粉50～60％。最优选地，所述滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.5％、蜜糖3.0％、酵母0.5％、无菌水40％、纤维素0.5％、吐温-801.0％、滑石粉54.5％。另外，上述制剂在防治烟粉虱和/或柑橘木虱或其引起病害方面的应用，以及在制备防治烟粉虱和/或柑橘木虱、或防治烟粉虱和/或柑橘木虱引起病害的药物方面的应用，也应在本发明的保护范围之内。本发明具有以下有益效果：经长期的侵染生物学和室内、野外生物测定，本发明的滑石基质爪哇虫草孢子制剂对柑橘木虱等农业害虫具有很强的侵染杀虫效果，属广谱高效的微生物杀虫剂，且具有如下明显的优势：1.微生物农药来源于自然环境，具有选择性强、已获取的特点。2.对人畜等生物安全，无环境污染，对环境相容性好。3.对天敌较安全，它具有对目标害虫毒杀的选择性，不容易产生抗药性。4.生产工艺比较简单，便于大规模生产，开发与登记等费用低于化学农药等特性。本发明的滑石基质爪哇虫草孢子制剂在农业害虫的生物防治中具有良好的应用前景。附图说明图1为爪哇虫草菌株gzq-1的形态图。图2为爪哇虫草菌株gzq-1的分子鉴定系统发育树。图3为滑石基质爪哇虫草孢子制剂对柑橘木虱产卵量的影响；图中柱上“*”表示成对样本t检验差异显著(p＜0.05，f＝0.912，df＝14，t＝3.973)。图4为野外条件下滑石基质爪哇虫草孢子制剂、玫烟色虫草及无菌水对柑橘木虱成虫的存活率；数据为三个重复的平均值±标准误。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1爪哇虫草菌株gzq-1的分离与鉴定1、材料来源(1)样品：爪哇虫草菌由华南农业大学教育部生物防治工程研究中心续代保存，对该菌株保存样品采用单胞分离获得纯化菌株。(2)马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda)：200g去皮马铃薯，切成小块，加水1l，煮沸20min，纱布过滤：趁热加葡萄糖20g，琼脂18～20g，搅拌使之溶解混匀，定容至锥形瓶中，放在高压灭菌锅(121℃，30min)中灭菌30min。(3)无菌操作条件：所有器皿和用具须经过高压锅灭菌(121℃，30min)，接种等操作均在超净工作台内进行。(4)培养条件：置于25℃光照(12l：12d)恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到pda斜面，再转入4所说的冰箱贮存。2、菌株的分离与纯化(1)分离该菌株由发明人欧达在2017年6月采集于华南农业大学长岗山2号网室的九里香叶片上被寄生的柑橘木虱成虫虫体，方法是：利用5％的次氯酸钠溶液对样品进行表面消毒，消毒后的样品在灭菌水中冲洗三次，并放入pda平板中，倒置于25℃恒温箱中培养，待菌落形成后，转移到pda斜面中，再转入4℃冰箱贮存。(2)纯化对分离株分别在pda培养基上培养10d，待其形成孢子后，挑取分生孢子制成1×103孢子/ml的分生孢子悬浮液，将悬液滴于放有盖玻片的载玻片上，在生物显微镜下观察，将一个液滴中只有一个分生孢子的玻片插入培养基上，放在培养箱中培养，获得分离株。3、爪哇虫草分离株的筛选虫生真菌在遗传、生态及生物学等方面具有多样性。高产优质菌株的筛选与获得是取得较好防治效果的首要前提。菌株筛选主要考虑3个指标分别是产孢量、菌落生长速率、致病力。本发明以这些指标为依据，筛选优良菌株。(1)供试菌株的处理经纯化的爪哇虫草菌株，在pda平板于25℃的恒温箱(12l：12d)中培养。(2)供试昆虫与寄主植物柑橘木虱，来自教育部生物防治工程研究中心网室内九里香上的继代繁殖种群。九里香murrayapaniculatal.，在广州增城购买大量的九里香嫩苗，种植在华南农业大学教育部生物防治工程研究中心的网室内。(3)菌落生长速率和产孢量的测定爪哇虫草菌株配制成1×106孢子/ml浓度的分生孢子悬浮液，取1ml滴入直径为9cm的pda平板内，用三角玻璃棒涂匀，待7d长出菌丝后用直径为13mm的打孔器取新鲜菌落，然后接种于pda培养基上培养，5个重复，10天后测记菌落直径并于第10天收集分生孢子用血球计数器测定产孢量。爪哇虫草分离株gzq-1的菌落生长速率和产孢量见表1。表1爪哇虫草分离菌株菌落直径扩展量和产孢量(10d)菌株直径扩展±se(mm)产孢量(分生孢子/ml)gzq-142.3±1.862.26×108(4)分离菌株对各龄期柑橘木虱的致病力将分离菌株接种于pda平板上培养10d后，用0.03％的吐温-80无菌水收集分生孢子，配制成1×103、1×104、1×105、1×106、1×107孢子/ml孢子悬浮液，喷洒至含有柑橘木虱的九里香嫩芽致叶面形成水滴，每个嫩芽上留有1-2龄若虫、3-4龄若虫、5龄若虫及成虫各10头，对照喷洒0.03％的吐温-80无菌水，每个处理设置3个重复。将实验植株置于26±1℃，l：d＝12：12的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在90％以上，每隔2天记录其死亡率，共记录7天。生物测定结果表明，感染后第7天，gzq-1菌株对柑橘木虱1-2龄若虫、3-4龄若虫、5龄若虫及成虫校正死亡率分别为91.7±2.36％，88.3±4.33％，73.3±3.32％和72.2±2.94％。(5)爪哇虫草分离株的筛选结果在筛选优良分离株时，以菌株的产孢量、致病力、菌落生长速率为重要的参考指标。在本发明中，通过这三个评判标准来比较，菌株gzq-1性状优良，具有致病力强、产孢量多的特点，通过菌株gzq-1对不同龄期柑橘木虱校正死亡率可知其对柑橘木虱各龄期均具有高致病力。综合比较各方面因素，菌株gzq-1对柑橘木虱各龄期均具有高致病力。4、爪哇虫草分离株的鉴定经过形态学及分子学鉴定，该菌株属肉座菌目，虫草属。该菌株的分生孢子梗直，分生孢子呈长卵型，且相连成链(图1、2)。发明人将该菌株命名为爪哇虫草(cordycepsjavanica)菌株gzq-1，于2018年8月20日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，菌株保藏编号：gdmccno：60437，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。实施例2滑石基质爪哇虫草孢子制剂的制备1、滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.5％、蜜糖3.0％、酵母0.5％、无菌水40％、纤维素0.5％、吐温-801.0％、滑石粉54.5％。2、制剂制备方法为：按照上述配比，将蜜糖、酵母和无菌水混合配置成培养基，将爪哇虫草菌丝置于培养基中摇菌3日后，将所得菌液与纤维素、吐温-80投入滑石粉中，经搅拌器充分搅拌均匀，干燥72小时后，制成滑石基质爪哇虫草孢子制剂。3、滑石基质爪哇虫草孢子制剂孢子萌发率的测定将上述制备的制剂储藏2和15天后，以80～100克/升的配比将该制剂与水充分拌匀成悬浮液，静置30min后，取上清液加入sday培养基中，使其浓度在1×106孢子/ml，于25℃和125r/min条件下培养，待24h后取出镜检并计算孢子萌发率，以课件芽管长度大于孢子宽度一半作为孢子已萌发标准重复测定5次。结果如表2所示。表2滑石基质爪哇虫草孢子制剂孢子萌发率样品2日萌发率(％)15日萌发率(％)制剂91.9±1.886.6±2.4由表2可知，滑石基质爪哇虫草孢子制剂的2天孢子萌发率高达91.9％，且在配制2和15天是无明显差异的，滑石基质爪哇虫草孢子制剂配方对孢子有保护作用，保存时间更持久。4、实验测试：吐温-80对制剂致病效果的影响(1)药剂按照上述制剂制备方法制作对照组制剂，不同之处在于：不加吐温-80。以80～100克/升的配比将该两组制剂与水充分拌匀成悬浮液，静置30min后，取上清液。(2)供试昆虫与寄主植物：柑橘木虱，来自教育部生物防治工程研究中心网室内九里香上的继代繁殖种群。九里香murrayapaniculatal.，在广州增城购买大量的九里香嫩苗，种植在华南农业大学教育部生物防治工程研究中心的网室内。(3)实验方法将添加吐温-80和未添加吐温-80的制剂悬浮液喷洒于接有20头柑橘木虱2龄若虫的九里香嫩芽，喷洒至叶面有水珠即可，每个处理设置3个重复。将处理过的嫩芽套袋置于26±1℃，l：d＝12：12的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在90％以上，每隔2天记录其死亡率，共记录7天。表3有无吐温-80制剂对柑橘木虱2龄若虫致病力的回归方程及参数吐温-80致病力回归方程lc50和95％置信区间(g/l)r2有y＝0.587x+0.5481.13(0.33～2.8)×1050.989无y＝0.423x+0.5153.27(0.3～12.29)×1060.596结果如由表3所示，当制剂添加了吐温-80时，其致病力显著提高，lc50达到1.13×105，显著高于无吐温-80制剂。由此可知，成分吐温-80对制剂致病效果的影响较大，同爪哇虫草一样是该配方核心成分。实施例3滑石基质爪哇虫草孢子制剂的制备1、滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.4％、蜜糖2.0％、酵母0.4％、无菌水45％、纤维素0.4％、吐温-800.8％、滑石粉51％。2、制备方法同实施例1，制剂孢子萌发率测定结果显示，萌发率高，保存时间持久。实施例4滑石基质爪哇虫草孢子制剂的制备1、滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.6％、蜜糖4.0％、酵母0.6％、无菌水35％、纤维素0.6％、吐温-801.2％、滑石粉58％。2、制备方法同实施例1，制剂孢子萌发率测定结果显示，萌发率高，保存时间持久。实施例5滑石基质爪哇虫草孢子制剂的制备1、滑石基质爪哇虫草孢子制剂中，各组分重量百分比配比如下：爪哇虫草菌丝0.1％、蜜糖1.0％、酵母0.15％、无菌水30％、纤维素0.15％、吐温-801.0％、滑石粉67.6％。2、制备方法同实施例1，制剂孢子萌发率测定结果显示，萌发率高，保存时间持久。以下实施例以实施例1的制剂为例，测试其对目标害虫的防治作用。实施例6制剂对柑橘木虱若虫的致病力1、生物测定是检测制剂对目标害虫种群影响的有效手段之一，能为综合评价该制剂的生物防治潜力提供重要的参考依据。本研究就滑石基质爪哇虫草孢子制剂对柑橘木虱若虫致病力进行测定，以期确定其对柑橘木虱若虫有理想的防治效果并筛选出理想浓度。2、材料来源将制剂总重中0.5％爪哇虫草菌丝置于含总重3.0％蜜糖、0.5％酵母和40％无菌水配置而成的培养基中摇菌3日后，，依次取制剂总重的0.5％纤维素、1％吐温-80、及上述爪哇虫草菌液投入54.5％的滑石粉中，经搅拌器充分搅拌均匀，干燥72小时后，制成滑石基质爪哇虫草孢子制剂。后以1:0.3、1:3、1:30、1:300、1:3000的配比将该制剂与水充分拌匀成悬浮液，静置30min后，取上清液。以无菌水作对照。3、供试昆虫与寄主植物柑橘木虱，来自教育部生物防治工程研究中心网室内九里香上的继代繁殖种群。九里香murrayapaniculatal.，在广州增城购买大量的九里香嫩苗，种植在华南农业大学教育部生物防治工程研究中心的网室内。4、制剂对柑橘木虱柑橘木虱2龄若虫致病力的测定将制剂悬浮液喷洒于接有10头柑橘木虱2龄若虫的九里香嫩芽，喷洒至叶面有水珠即可，每个处理设置3个重复。将处理过的嫩芽套袋置于26±1℃，l：d＝12：12的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在90％以上，每隔2天记录其死亡率，共记录7天。5、制剂对柑橘木虱2龄若虫致病力的回归方程及参数如表4所示。表4制剂对柑橘木虱2龄若虫致病力的回归方程及参数回归分析参数致病力回归方程y＝0.587x+0.548lc50(g/ml)1.13×10595％置信区间(g/ml)0.33～2.8×105r20.989实施例7制剂对柑橘木虱产卵量的影响1、生物测定是检测制剂对目标害虫种群影响的有效手段之一，能为综合评价该制剂的生物防治潜力提供重要参考依据。本研究就滑石基质爪哇虫草孢子制剂对柑橘木虱产卵量进行测定，以确定其对柑橘木虱产卵量有理想的抑制效果。2、材料来源将制剂总重中0.1％爪哇虫草菌丝置于含总重1.0％蜜糖、0.15％酵母和30％无菌水配置而成的培养基中摇菌3日后，，依次取制剂总重的0.15％纤维素、1％吐温-80、及上述爪哇虫草菌液投入67.6％的滑石粉中，经搅拌器充分搅拌均匀，干燥72小时后，制成滑石基质爪哇虫草孢子制剂。后以80～100克/升的配比将该制剂与水充分拌匀成悬浮液，静置30min后，取上清液。以无菌水作对照。3、供试昆虫与寄主植物柑橘木虱，来自教育部生物防治工程研究中心网室内九里香上的继代繁殖种群。九里香murrayapaniculatal.，在广州增城购买大量的九里香嫩苗，种植在华南农业大学教育部生物防治工程研究中心的网室内。4、制剂对柑橘木虱产卵量的影响将制剂悬浮液喷洒于接有一头产卵初期柑橘木虱成虫的九里香嫩芽，喷洒至叶面有水珠即可，每个处理设置8个重复。将处理过的嫩芽套袋置于26±1℃，l：d＝12：12的恒温气候箱中培养，并将湿度保持在90％以上，3d后记录柑橘木虱的产卵量。制剂对柑橘木虱产卵量的影响结果如图3所示，滑石基质爪哇虫草孢子制剂使柑橘木虱产卵量显著下降，单头产卵平均数为9.375枚(8个生物学重复中，其中6个直接死亡而无产卵数)，而对照单头产卵平均数则为58.375枚，差异显著(p＜0.05，f＝0.912，df＝14，t＝3.973)。实施例8制剂对柑橘木虱成虫田间防治在野外条件下用滑石基质爪哇虫草孢子制剂悬浮液(100克/升)处理柑橘木虱成虫，以另一专利玫烟色虫草cordycepsfumosorosea菌株if010(公开号：cn106065392a)(配制与制剂同样浓度孢子悬浮液)及无菌水作为对照，其7天的存活率见图4，在处理后第7天时，滑石基质爪哇虫草孢子制剂对柑橘木虱成虫死亡率达到了44％，且显著高于玫烟色虫草及无菌水。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12