一株防治细菌病害短小芽孢杆菌ZR3-3及其应用的制作方法

本发明涉及一种生防菌剂及其应用，尤其是一株短小芽孢杆菌zr3-3及其在防治植物细菌病害中的应用。

背景技术：

细菌病害是由病原细菌侵染所致的病害，如软腐病、青枯病、白叶枯病等。侵害植物的细菌都是杆状菌，大多数具有1至数根鞭毛，可通过自然孔口(气孔、皮孔、水孔等)和伤口侵入，借流水、雨水、昆虫等传播，在病残体、种子、土壤中过冬，在高温、高湿条件下容易发病。细菌病害症状表现为萎蔫、腐烂、穿孔等，发病后期遇潮湿天气，在病害部位溢出细菌粘液，有明显恶臭味，是细菌病害的特征。目前，生产上防治植物细菌病害主要依靠噻枯唑、铜制剂等化学农药，不仅造成生态环境严重污染，而且直接增加农产品中有毒化学物质的残留，对人类健康带来严重危害。为了达到有效防治植物病害、减少化学农药使用量的目的，使用生物防治技术控制植物病害的方法越来越受到各国政府和人民的关注。生物防治技术主要是利用生物多样性，通过在自然界释放或引进有益微生物，可持续控制植物病害。1950年以来国内外均开展了利用生防菌剂防治植物细菌病害的研究，生防菌主要有：芽孢杆菌(bacillus)、假单胞菌(pseudomonads)等。

江苏省农业科学院从西藏草原采集的土样中，分离纯化后获得一株新颖的生防菌株zr3-3。前期研究结果表明：生防菌株zr3-3对生产上多种细菌病害(软腐病、青枯病、白叶枯病、细菌性条斑病、黑腐病等)、真菌病害(如炭疽病、纹枯病、菌核病、枯萎病等)有很好的防治效果。经中国科学院微生物研究所检测鉴定，根据细胞形态、生理生化特征、16srrna基因序列等实验数据综合分析，菌株zr3-3鉴定为短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)。短小芽孢杆菌zr3-3已于2018年11月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.16740。

已有文献报道的短小芽孢杆菌主要防治真菌病害，包括棉花黄萎病(刘杉等，2018年，《河南大学学报》)、大豆疫霉(曹舜等，2015年，安徽农业大学博士论文)、烟草黑胫病(王静等，2010年，《中国烟草学报》)、烟草赤星病和白粉病(王静等，2015年，《应用生态学报》)、水稻穗颈瘟(朱桂梅等，2007年，《安徽农业科学》)、水稻纹枯病(jasdeepchatrathpadaria等，2016年，《journalofbasicmicrobiology》；aminrostami等，2017年，《pesticidebiotechnologyandphysiology》)、油菜菌核病(manojkaushal等，2017年，《biotech》)、根结线虫(yongseonglee等，2016年，《journalofphytopathology》)、镰刀菌(ranjitgurav等，2017年，《internationalbiodeterioration&biodegradation》；abbasshali等，2010年，《phytoparasitica》)、青霉菌(haijiaoyan等，2018年，《worldjournalofmicrobiologyandbiotechnology》)等。已有短小芽孢杆菌申请和授权专利主要防治对象是真菌病害，包括水稻稻瘟病、小麦禾谷孢囊线虫病、苹果斑点落叶病、草莓炭疽病、小麦纹枯病和果树腐烂病等(专利申请号：cn201711171896.x；cn201310046055.1；cn201510502270.7；cn201510312295.0；cn201510219845.4；cn201410339603.4)。另外还有一些堆肥或微生物秸秆腐熟剂中含有短小芽孢杆菌(专利申请号：201310560992.9)，可以分解秸秆，同时具有生物防治功能，室内试验结果表明能抑制水稻纹枯病菌、水稻白叶枯病菌的生长。

目前国内外有2篇利用短小芽孢杆菌防治番茄青枯病的报道(1、连玲丽等，2009年，《福建农林大学学报》；2、minshen等，2017年，actaagriculturaescandinavica，sectionb-soil&plantscience)，作用原理主要是诱导植物抗性和衰弱病菌毒性。而申请人分离获得的短小芽孢杆菌zr3-3作用机理和标靶病原菌与之完全不同，具体如下：1、短小芽孢杆菌zr3-3活菌体可以室内外直接抑制细菌病害生长，不同于已经报道的诱导抗性和衰弱病菌毒性等作用机理；2、众所周知，短小芽孢杆菌是生产应用上较为广阔的一类生防菌。需要强调的是：在短小芽孢杆菌这个大家族中，不同菌株的作用靶标不完全一致。一株短小芽孢杆菌对病原菌有抑制作用，并不能代表所有的短小芽孢杆菌对病原菌均有抑制作用。申请人分离获得的短小芽孢杆菌zr3-3对番茄青枯病、辣椒青枯病均有防治作用，其他短小芽孢杆菌未必对辣椒青枯病有防治作用。辣椒青枯病和番茄青枯病虽然都是劳尔氏菌属，但是侵染不同寄主会产生不同专化型、致病性等特质。换句话说，已有文献报道防治番茄青枯病的短小芽孢杆菌不一定就能防治辣椒青枯病。

短小芽孢杆菌zr3-3(bacilluspumilus)是由申请人采样分离获得一株新菌株，能有效防治大白菜软腐病、辣椒青枯病、水稻白叶枯病、水稻细菌性条斑病等细菌性病害，国内外未见相关报道，具有创造性和新颖性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一株具有较好应用前景的生防菌株-短小芽孢杆菌(bacilluspumilus)zr3-3，该菌株已于2018年11月15日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记入册，地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为cgmccno.16740。

本发明提供了一种生防菌剂，其中有效活性成分由短小芽孢杆菌zr3-3组成。

本发明所述的生防菌剂，其中短小芽孢杆菌zr3-3分泌的代谢产物中包括蛋白酶、嗜铁素和几丁质酶三种抗菌相关物质。

本发明所述的生防菌剂，它是水剂。

本发明所述的水剂，其特征在于：各组成及重量百分含量如下：短小芽孢杆菌zr3-3：89.5-99.8％；十二烷基磺酸钠：0.1-10％；山梨酸钾：0.1-0.5％；ph6.5-7.0。

本发明所述的水剂灌根用于防治大白菜软腐病和辣椒青枯病，水稻叶面均匀喷施用于防治水稻白叶枯病和水稻细菌性条斑病。

本发明的优点在于：开发出一株对人畜安全、具有较好应用前景的生防菌株-短小芽孢杆菌zr3-3，丰富了生防资源；该生防菌剂可以用来防治多种植物细菌病害，减少生产中化学药剂的使用量，同时改善生态环境、减少化学药剂在农产品中的残留量。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。

图1是短小芽孢杆菌zr3-3对病原细菌的抑制作用

图2是短小芽孢杆菌zr3-3产生蛋白酶。

图3是短小芽孢杆菌zr3-3产生嗜铁素。

图4是短小芽孢杆菌zr3-3产生几丁质酶。

图中a：短小芽孢杆菌zr3-3；b：大白菜软腐病菌；c：辣椒青枯病菌；d：水稻白叶枯病菌；e：水稻细菌性条斑病菌。

具体实施方式：

实施例1、

短小芽孢杆菌zr3-3对病原细菌的抑制作用

a、供试病原细菌

供试细菌包括白菜软腐病菌、辣椒青枯病菌、水稻白叶枯病菌和水稻细菌性条斑病菌，由江苏省农业科学院植物保护研究所提供。用lb培养液(蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，nacl10g，蒸馏水1000ml)28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁸cfu/ml，备用。

b、试验方法：

将江苏省农业科学院筛选获得的短小芽孢杆菌zr3-3在lb培养基上进行活化，然后移入50mllb培养液中，于28℃、150rpm振荡培养2d，用无菌水稀释至10⁸cfu/ml，备用。

吸取短小芽孢杆菌zr3-3菌液5μl，点接在lb平板中央，28℃培养48h后用病原细菌稀释液喷雾，28℃培养过夜，调查抑菌圈直径。每处理重复3次，取平均值。设清水对照。

c、试验结果：

试验结果见图1。短小芽孢杆菌zr3-3菌液对对供试的4种细菌均有一定的抑制作用，对白菜软腐病菌的抑菌圈直径为70.2mm；对辣椒青枯病菌的抑菌圈直径为31.7mm；对水稻白叶枯病菌的抑菌圈直径为27.5mm；对水稻细菌性条斑病菌的抑菌圈直径为66.2mm。

如图1所示。

实施例2

短小芽孢杆菌zr3-3代谢分泌物-抗菌相关物质的产生

供试材料：蛋白酶检测培养基：脱脂奶粉100g，琼脂20g，定容至1000ml。嗜铁素检测培养基：cas60.5mg，10ml三价铁溶液(1mmol.l^-1fecl3·6h2o)，hdtma72.9mg，琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0。几丁质酶检测培养基：几丁质15g，mgso4·7h2o0.5g，fes04·7h2o0.01g，k2hp040.7g，kh2p040.3g，琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0-7.2。纤维素酶检测培养基：蛋白胨10g，酵母粉10g，羧甲基纤维素钠10g，nacl5g，kh2po41g，琼脂20g，定容至1000ml，ph7.0。

短小芽孢杆菌zr3-3菌液制备同实施例1。在各检测培养基平板中央点接短小芽孢杆菌zr3-3菌液5μl，每处理重复3次。28℃恒温培养3-7d，观察。

蛋白酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌蛋白酶。

嗜铁素检测：28℃恒温培养7-10d后观察有无黄色晕圈产生。若产生黄色晕圈，说明该拮抗菌可分泌嗜铁素。

几丁质酶检测：观察有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌几丁质酶，降解几丁质。

纤维素酶检测：观察菌落周围有无透明圈产生。若产生透明圈，说明该拮抗菌可分泌纤维素酶。

试验结果表明：短小芽孢杆菌zr3-3不能分泌纤维素酶；能分泌蛋白酶，利用检测平板中的蛋白质，在菌落周围形成透明圈(图2)；能分泌嗜铁素，与检测平板中的fe³⁺结合，在菌落周围形成桔黄色晕圈(图3)；能分泌几丁质酶，利用检测平板中的几丁质，在菌落周围形成透明圈(图4)。

如图2、图3和图4所示。

实施例3

短小芽孢杆菌zr3-3水剂的获得

a、菌种准备及活化。

lb培养基(同实施例1)按常规方法加琼脂后灭菌，做成斜面。接种短小芽孢杆菌zr3-3，28℃培养2d。

b、液体发酵。

一级发酵：将上述培养好的试管斜面，用接种环移一环菌苔入300mllb培养液。在28℃、150rpm振荡培养2d，备用。

二级发酵：培养基配方：豆饼粉1％，大豆粉0.5％，酵母膏0.15％，玉米粉1％，玉米浆0.5％，蔗糖0.5％，nacl0.05％，caco30.18％。灭菌前ph7.0。2吨发酵罐中投料1吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述一级发酵菌种液300ml。液体发酵温度32℃，搅拌转速300rpm。通气量1∶1.5。发酵周期为18小时。

三级发酵：培养基配方同二级发酵。15吨发酵罐中投料10吨。121℃灭菌30分钟。冷却至30℃左右时接种上述二级发酵菌种液1吨。液体发酵温度32℃，搅拌转速300rpm。通气量1∶1.5。发酵周期为24小时左右，放罐。

c、水剂配置。

发酵液放入储罐中，加入十二烷基磺酸钠0.1-10％、山梨酸钾0.1-0.5％，搅拌均匀。测得发酵液ph值为6.5-7.0，活菌数为10⁹cfu/ml。灌装成短小芽孢杆菌zr3-3水剂。

实施例4

短小芽孢杆菌zr3-3水剂对大白菜软腐病的防治试验

试验地点：江苏省连云港市赣榆区雅仕农场进行。

试验品种：夏丰，又名伏宝，由江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。

试验药剂和对照药剂：短小芽孢杆菌zr3-3水剂由实施例3提供。对照药剂为2％春雷霉素可湿性粉剂，购自吉林省延边春雷生物药业有限公司，按其田间推荐剂量使用。

试验方法：大白菜移栽后10d、17d、25d各灌根1次，每株灌药液250ml。试验设5个处理：：短小芽孢杆菌zr3-3水剂100倍稀释液、zr3-3水剂200倍稀释液、2％春雷霉素可湿性粉剂750倍稀释液、2％春雷霉素可湿性粉剂1500倍稀释液和清水对照。4次重复，共20个小区，每个小区面积为20m²，随机排列。药后35d和55d每小区随机取样调查50棵大白菜，调查发病情况，计算发病指数和防效。病害分级标准如下：

0级：无症状；

1级：叶片始见水渍状褐色病斑；

3级：底部1-2叶片基部有明显病斑；

5级：外部叶片有1/3-1/2腐烂；

7级：外部叶片全部腐烂；

9级：整株腐烂。

病情指数＝[(各级发病数×各级代表值)/(调查总株数×最高级代表值)]×100

防治效果(％)＝[(对照的病情指数-防治的病情指数)/对照的病情指数]×100％

试验结果见表2。用药35d后短小芽孢杆菌zr3-3水剂100倍稀释液的防效最高，为83.10％，对照药剂2％春雷霉素可湿性粉剂750倍稀释液的防效次之，为75.35％，两者呈显著性差异。短小芽孢杆菌zr3-3水剂200倍稀释液与2％春雷霉素可湿性粉剂1500倍稀释液的防效相当。药后55d，清水对照的病情指数增加显著，短小芽孢杆菌zr3-3水剂100倍稀释液的防效为81.48％，2％春雷霉素可湿性粉剂750倍稀释液的防效为75.21％，两者依然呈显著性差异。结果表明：短小芽孢杆菌zr3-3防治大白菜软腐病效果显著。

表2短小芽孢杆菌zr3-3水剂对大白菜软腐病的田间防治效果

注：同一列不同小写字母表明呈显著性差异。

实施例5

短小芽孢杆菌zr3-3水剂防治番茄、辣椒青枯病的田间小区试验

试验地点：江苏省苏州三港农副产品配送有限公司设施大棚。

试验品种：霞粉3号，苏椒17号，江苏省农业科学院蔬菜研究所提供。

试验药剂：短小芽孢杆菌zr3-3水剂由实施例3提供，对照药剂为3％中生菌素可湿性粉剂，购自深圳诺普信农化股份有限公司，按其田间推荐剂量使用。

试验方法：选取番茄青枯病和辣椒青枯病自然发病较重的2个温室大棚为试验大棚。试验用苗按常规操作，经穴盘育苗和定植两个阶段。穴盘播种时，将短小芽孢杆菌zr3-3水剂按1∶50的比例稀释，每穴浇灌50毫升；定植移栽时，将短小芽孢杆菌zr3-3水剂按照1∶100的比例进行灌根，每棵苗灌根200毫升；定植后隔15天，将短小芽孢杆菌zr3-3水剂按照1∶100的比例进行灌根，每棵苗灌根500毫升。试验药剂：短小芽孢杆菌zr3-3水剂、3％中生菌素可湿性粉剂和清水对照。每个处理小区约500棵苗，重复2次，处理小区随机分布。对照小区番茄、辣椒发病时调查发病情况，计算防效。

发病率＝调查小区发病株数/调查总株数*100

防效＝(处理小区的发病率-对照小区的发病率)/对照小区的发病率

试验结果见表3。对照病田中番茄青枯病的发病率为18.46％，短小芽孢杆菌zr3-3水剂对番茄青枯病的田间防效为72.70％，3％中生菌素可湿性粉剂的防效为59.26％，两者呈显著性差异。对照病田中辣椒青枯病的发病率为53.27％，短小芽孢杆菌zr3-3水剂对辣椒青枯病的田间防效为71.75％，3％中生菌素可湿性粉剂的防效为46.05％，两者呈显著性差异。试验结果表明：短小芽孢杆菌zr3-3水剂能有效防治番茄青枯病、辣椒青枯病。

表3短小芽孢杆菌zr3-3水剂对番茄、辣椒青枯病的田间防治效果

注：同一列不同小写字母表明呈显著性差异。

实施例6

短小芽孢杆菌zr3-3水剂防治水稻细菌性条斑病和白叶枯病的田间小区实验

试验地点：江苏省农业科学院试验田。

试验药剂：短小芽孢杆菌zr3-3水剂由实施例3提供，对照药剂为20％噻枯唑可湿性粉剂，购自浙江龙湾化工有限公司提供)，按药剂说明书使用。

在水稻白叶枯病、细菌性条斑病发病初期(田间零星发病)叶片喷雾施药，间隔10d左右进行第二次防治。调查方法：发病初期每小区随机选取4点，每点5穴，调查每个分蘖最上部3片叶。施药前调查各处理发病基数，初次施药21d后再次调查病情指数。

分级标准：0级，无病斑；1级，病斑占叶片面积＜5％；3级，病斑面积占叶片面积6％～15％；5级，病斑面积占叶片面积16％～30％；7级，病斑面积占叶片面积31％～50％；9级，病斑面积占叶片面积＞50％。

病情指数＝∑(各级发病数×各级代表值)/(调查总叶片数×最高级代表值)×100；

防治效果％＝[1-(处理区药后病情指数×对照区药前病情指数)/(处理区药前病情指数×对照区药后病情指数)]×100％。

试验结果见表4。对照药剂对水稻细菌性条斑病和白叶枯病的防效分别为48.18％和65.39％，短小芽孢杆菌zr3-3水剂每亩按33.3-50ml的用量，对水稻细菌性条斑病和白叶枯病的防效分别为50.24-54.24％和60.25-65.39％，对水稻细菌性条斑病和白叶枯病的防效与对照药剂相当；如果每亩按100ml的用量，对水稻细菌性条斑病和白叶枯病的防效分别为61.99％和73.08％；防效显著，与对照药剂均呈显著性差异。

表4短小芽孢杆菌zr3-3水剂对水稻细菌性条斑病和白叶枯病的田间防治效果