一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法与流程

本发明涉及生物农药技术领域，特别涉及一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法。

背景技术：

植物内生菌是定殖在健康植物组织内，并与植物建立和谐联合关系的一类微生物，一方面植物为其提供生长所需的能量和营养；另一方面植物内生菌可通过生物固氮、分泌抗菌物质、增强植物对干旱等不良环境的胁迫而促进作物生长、提高植物抗病、抗逆能力，是进行微生物肥料或微生物农药开发的一类天然资源菌。而且植物内生菌定殖于植物组织内部，可受到植物组织的保护，比暴露于恶劣环境(强烈的日光、紫外线、暴风雨等)中的附生微生物具有更稳定的生存环境，更易于其生物功能的发挥。因此，植物内生菌是微生物肥料与农药开发的新兴微生物资源，具有广阔的理论研究价值和开发应用前景。

植物内生菌的种类也十分繁多，主要包括内生细菌、内生真菌和内生放线菌三大类。截止2010年，在各种农作物及经济作物中发现的植物内生细菌已超过129种，分属于54个属，主要为假单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属、土壤杆菌属、克雷伯氏菌属、泛菌属、甲基杆菌属等。芽孢杆菌具有较强的抑菌作用，灭害力强，具有占据空间优势，抑制有害菌、病原菌等有害微生物的的生长繁殖，可作为生物农药的添加物质被制备成多种剂型。

可湿性粉剂是将原药、填料、表面活性剂及其他助剂等一起混合粉碎所得到的一种很细的干剂，它的性能要求主要有润湿性、分散性、悬浮性。芽孢杆菌可湿性粉剂研制的关键是质量控制，许多国家或国际组织为了控制农药制剂的质量，都制定了一些质量标准，在生产和使用过程中，芽孢杆菌菌体活性及药液的悬浮率、润湿性、水含量、细度等直接影响到常药效的发挥。相比于化学农药，生产上使用的一些微生物农药产品常常出现含水量偏高、悬浮率低、稳定性差等现象，使微生物农药的效果得不到充分的发挥微生物农药质量问题，相当大程度上已成为制约其产业化和应用开发的一个瓶颈。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法。本发明所制备的芽孢杆菌可湿性粉剂具有芽孢含量高、悬浮率高、润湿时间短、稳定性较好等优点，可明显提高其对植物病害的防治效果。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种芽孢杆菌可湿性粉剂，包括芽孢杆菌发酵液、硅藻土、三聚磷酸钠、朗钛lt-wp60、黄原胶和羧甲基纤维素钠。

作为优选，以重量份计，该芽孢杆菌可湿性粉剂中各组分的用量为：

优选地，以重量份计，该芽孢杆菌可湿性粉剂中各组分的用量为：

更优选地，以重量份计，该芽孢杆菌可湿性粉剂中各组分的用量为：

在本发明提供的一具体实施例中，以重量份计，该芽孢杆菌可湿性粉剂中各组分的用量为：

在本发明提供的另一具体实施例中，以重量份计，该芽孢杆菌可湿性粉剂中各组分的用量为：

在本发明提供的具体实施例中，芽孢杆菌发酵液为解淀粉芽孢杆菌发酵液。

在本发明提供的具体实施例中，芽孢杆菌发酵液为解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液。

作为优选，芽孢杆菌发酵液的活菌数为(5～8)×10⁹cfu·ml^-1。

优选地，芽孢杆菌发酵液的活菌数为(5.331～7.744)×10⁹cfu·ml^-1。

作为优选，芽孢杆菌发酵液的制备方法：将芽孢杆菌接入nb液体培养基中，发酵培养10～20h，得到芽孢杆菌发酵液。

作为优选，在芽孢杆菌发酵液的制备方法中，芽孢杆菌种子液的接种量为0.5％v/v～1.5％v/v。

在本发明提供的具体实施例中，在芽孢杆菌发酵液的制备方法中，芽孢杆菌种子液的接种量为1％v/v。

本发明还提供了该芽孢杆菌可湿性粉剂在制备防治灰霉病、早疫病、枯萎病药物中的应用。

在本发明提供的具体实施例中，灰霉病为番茄灰霉病。

在本发明提供的具体实施例中，早疫病为番茄早疫病。

在本发明提供的具体实施例中，枯萎病为番茄枯萎病。

本发明还提供了该芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法，将芽孢杆菌发酵液、硅藻土、三聚磷酸钠、朗钛lt-wp60、黄原胶和羧甲基纤维素钠混合制成母液，烘干，研磨，制成可湿性粉剂。

作为优选，烘干的温度为55～65℃。

在本发明提供的具体实施例中，烘干的温度为50℃。

本发明提供了一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法。该芽孢杆菌可湿性粉剂包括芽孢杆菌发酵液、硅藻土、三聚磷酸钠、朗钛lt-wp60、黄原胶和羧甲基纤维素钠。本发明具有的技术效果为：

本发明芽孢杆菌可湿性粉剂将载体硅藻土、分散剂三聚磷酸钠、润湿剂朗钛lt-wp60、保护剂黄原胶、稳定剂羧甲基纤维素钠组合，分散剂与润湿剂质量比例是7：3，分散剂与润湿剂加入量为12％～15％，所制备的芽孢杆菌可湿性粉剂具有芽孢含量高、悬浮率高、润湿时间短、稳定性较好等优点，可明显提高其对植物病害的防治效果，特别是对番茄枯萎病、番茄灰霉病和番茄早疫病有较好的防治效果，室内防治效果测定表明，在番茄离体果实上对番茄灰霉病和番茄早疫病防效分别可达85.7％和87.9％。

本发明在制备芽孢杆菌可湿性粉剂的过程中将液体发酵的产物一起与其他填料及助剂混合制备可湿性粉剂，可进一步提高防效。

附图说明

图1为可湿性粉剂对番茄果实的防效效果；注：a、b分别代表番茄早疫、番茄灰霉；1-3分别为稀释液的50×、100×和200×。

具体实施方式

本发明公开了一种芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

1、供试菌株及实验材料

菌株：gz-5菌株为本实验室从番茄根部分离的1株菌株解淀粉芽孢杆菌bacillusamyloliquefaciens(中国农业微生物菌种保藏管理中心accc编号：60428)；

载体：滑石粉(800目)、轻质碳酸钙(1250目)、硅藻土(800目)、高岭土(1250目)、活性土(500目)；

润湿剂：十二烷基磺酸钠(sds)、十二烷基苯磺酸钠(dbs-na)、洗衣粉(奇强牌)、拉开粉bx(丁基萘磺酸钠)、朗钛lt-wp60(朗钛科技有限公司)；

分散剂：木质素磺酸钠(sl)、朗钛cf200(朗钛科技有限公司)、羟甲基纤维素钠(cmc)、聚乙烯醇(pva)、三聚磷酸钠(stpp)；

稳定剂：磷酸氢二钠、羧甲基纤维素钠、黄原胶、碳酸钙；

紫外保护剂：维生素c、黄原胶、十二烷基硫酸钠。

2、发酵液的制备

种子液制备方法：用接种环挑取新鲜的内生细菌接入nb液体培养基中，装液量75ml/100ml，初始ph值为7.0，30℃摇床180r·min^-1振荡培养12h以备用。

发酵培养方法是以1％v/v接种量将种子液接入上述优化的发酵培养液中按照已优化的发酵条件进行优化培养，并获得最大芽孢含量(7.744×10⁹cfu·ml^-1)。

本发明提供的芽孢杆菌可湿性粉剂及其应用和制备方法中所用原料或辅料均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

以重量份计，本实施例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液(5.331×10⁹cfu·ml^-1)：75份；

硅藻土(载体)：10份；

三聚磷酸钠(分散剂)：9.8份；

朗钛lt-wp60(润湿剂)：4.2份；

黄原胶(保护剂)：0.1份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：2份。

制备方法：将发酵液、载体、分散剂、润湿剂、保护剂、稳定剂混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成可湿性粉剂。

实施例2

以重量份计，本实施例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液(6.025×10⁹cfu·ml^-1)：74份；

硅藻土(载体)：11份；

三聚磷酸钠(分散剂)：9份；

朗钛lt-wp60(润湿剂)：4.5份；

黄原胶(保护剂)：0.08份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：2.5份。

制备方法：同实施例1。

实施例3

以重量份计，本实施例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液(5.20×10⁹cfu·ml^-1)：76份；

硅藻土(载体)：9份；

三聚磷酸钠(分散剂)：11份；

朗钛lt-wp60(润湿剂)：4份；

黄原胶(保护剂)：0.12份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：1.5份。

制备方法：同实施例1。

试验例1载体种类对可湿性粉剂性能的影响

分别以滑石粉、轻质碳酸钙、硅藻土、高岭土、活性土做载体，分散剂、润湿剂、保护剂、稳定剂的种类及用量同实施例1。

将发酵液与载体等辅料混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，检测其润湿性、悬浮率，用平板菌落计数法测定室温贮藏14d后各制剂的芽孢含量，比较各载体制剂的性能、成本等因素。

载体在可湿性粉剂中所占有的比例比较大，选择一个优良的载体对可湿性粉剂的研制至关重要。因此需要选择悬浮率、润湿时间等综合方面都比较好的的填料作为可湿性粉剂的载体。通过表1可知活性土的悬浮率最高为57.59％，但润湿时间较高，芽孢存活率最低，不利于贮存，因而不适合作为载体。硅藻土的悬浮率为56.26％、润湿时间最好为68s、芽孢存活率较高为41.54％，因此硅藻土为菌株gz-5的最佳载体。

表1可湿性粉剂载体筛选

注:表中英文小写字母表示新复极差检验在p<0.05水平上的差异显著性(下同)。

试验例2

分别以十二烷基苯磺酸钠、拉开粉bx、十二烷基硫酸钠、朗钛wp60、洗衣粉作为润湿剂，载体、分散剂、保护剂、稳定剂的种类及用量同实施例1。

将发酵液与载体等辅料混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，测定制剂的悬浮性、润湿性和不同润湿剂对芽孢含量的影响。

润湿时间是助剂筛选的重要因素之一。通过表2可知，添加了朗钛wp60湿润剂的制剂润湿时间最短，为56s，悬浮率为55.31％，在5种湿润剂中性能中等，制剂中芽孢含量最高，达2.35×10⁹cfu/g；在5种湿润剂中，十二烷基硫酸钠的悬浮率最高，但其润湿时间达68s，制剂中芽孢含量仅为0.65×10⁹cfu/g，因此朗钛lt-wp60为内生芽孢杆菌gz-5制剂的最佳润湿剂。

表2可湿性粉剂润湿剂的筛选

试验例3

分别以木质素磺酸、木质素磺酸、三聚磷酸钠stpp、朗钛cf200、聚乙烯醇pva作为分散剂，载体、润湿剂、保护剂、稳定剂的种类及用量同实施例1。

将发酵液与载体等辅料混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，测定制剂的悬浮性、润湿性和不同分散剂对芽孢含量的影响及室温贮藏14d后芽孢含量。

分散率的高低是助剂筛选的重要因素之一。通过表3可知，添加了分散剂-木质素磺酸钙的制剂，芽孢量最多，达3.30×10⁹cfu·g^-1，但其悬浮率仅为40.91％。5种分散剂中，性能最好的是三聚磷酸钠，悬浮率可达68.11％，且润湿性相对比较好。综合考虑润湿性和悬浮率，木质素磺酸钙为内生芽孢杆菌gz-5制剂的最佳分散剂。

表3可湿性粉剂分散剂的筛选

试验例4

以重量份计，本试验例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液：75份；

硅藻土(载体)：10份；

三聚磷酸钠(分散剂)+朗钛lt-wp60(润湿剂)：14份；

黄原胶(保护剂)：0.1份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：2份。

将分散剂与润湿剂按1:9、2:8、3:7、4:6、5:5、6:4、7:3、8:2、9:1的质量比，与发酵液、载体、保护剂、稳定剂混合制成母液，其它组分种类及用量同实施例1。在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，测定其润湿时间和悬浮率，确定润湿剂与分散剂的最佳配比。

将筛选的润湿剂wp600和分散剂三聚磷酸钠为助剂进行复配比例筛选，通过分析可知(表4)，随着分散剂：润湿剂比例的提高，制剂的悬浮率也不断升高，但润湿时间也增加。当分散剂：润湿剂比例为9:1时，悬浮率达78.57％；湿润时间为61s，综合考虑悬浮率、润湿时间、芽孢含量和成本等因素，分散剂：润湿剂为7:3的组合为最佳配比，其制剂可达悬浮率72％，润湿时间51s。

表4可湿性粉剂分散剂和润湿剂的配比

试验例5

以重量份计，本试验例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液：75份；

硅藻土(载体)：补足100份；

三聚磷酸钠/朗钛lt-wp60(7:3)：2～15份；

黄原胶(保护剂)：0.1份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：2份。

将分散剂与润湿剂按7:3配比，以2、4、6、8、10、12、14、15份的加入量分别进行试验，选出制剂悬浮率与润湿时间相对较好的一组。

将上述筛选出的助剂及其复配比例进行助剂用量的筛选，由表5可知制剂中随着助剂用量的增加，其分散性和润湿性都随之增加，在添加14％，15％时，制剂的悬浮率、润湿时间与其他添加用量的制剂达到显著水平，但制剂中芽孢含量会有所下降，考虑到实际生产成本、芽孢含量等因素，在内生芽孢杆菌gz-5制剂中添加12％-14％为助剂的最佳用量。

表5可湿性粉剂助剂的用量筛选

试验例6

分别以碳酸钙、黄原胶、羧甲基纤维素钠、磷酸氢二钾作为稳定剂，载体、分散剂、润湿剂、保护剂的种类及用量同实施例1。

将发酵液与载体等辅料混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，热贮(54℃士2℃)14d后，用平板菌落计数法测定各制剂芽孢含量的变化，以不加稳定剂的制剂为对照。

湿性粉剂中稳定剂是对芽孢存活量及制剂货架期有着重要的作用，由表6可知，添加了2％羧甲基纤维素钠的芽孢杆菌制剂热贮14d后，芽孢的存活率为79.94％，与其稳定剂相比，达到了显著水平，因此羧甲基纤维素钠为内生芽孢杆菌gz-5制剂的最佳稳定剂。

表6可湿性粉剂稳定剂的筛选

试验例7

以重量份计，本实施例的菌株可湿性粉剂的配方：

解淀粉芽孢杆菌gz-5菌株发酵液：75份；

硅藻土(载体)：10份；

三聚磷酸钠(分散剂)：9.8份；

朗钛lt-wp60(润湿剂)：4.2份；

保护剂：0.1份；

羧甲基纤维素钠(稳定剂)：2份。

以维生素c、黄原胶、十二烷基硫酸钠作为保护剂。将发酵液与载体等辅料混合制成母液，在鼓风干燥箱内，60℃烘干、研磨制成母粉，稀释为0.005g/ml的母液，将其涂布于na平板上，在距40cm紫外灯(254nm，20w)处分别照射12h、24h，用平板菌落计数法测定菌落数，计算存活率。3次重复，以不加保护剂的制剂为对照。

紫外保护剂能够保护可湿性粉剂在应用过程中外部环境中紫外线对其芽孢活性的影响，起到保护芽孢的作用。试验结果表明(表7)，所选的3种紫外保护剂中，添加了黄原胶的制剂，紫外照射12d和24d后，芽孢存活率分别为76.64％和62.93％，与对照相比，差异显著，因此黄原胶为制剂的最佳紫外保护剂。

表7可湿性粉剂保护剂的筛选

试验例8可湿性粉剂质量检测

1、杂菌率测定

采用平板涂布法，取1g实施例1-3制剂用无菌水润湿和梯度稀释后，并将稀释液均匀涂布于na平板上，26.5℃恒温培养，待菌落形成后统计菌落总数，并记录真菌和其它杂菌的数量占总菌数的比例，即为杂菌率。

2、含水率测定

称取制剂样品10.00g(精确至0.01g)于干燥培养皿内，将培养皿和样品作为一个整体称重，然后将其放入105℃烘箱中烘干1h后取出，再置于干燥器中冷却至室温后称总重。

3、可湿性粉剂性能指标测定

按照国家相关标准分别测定内生芽孢杆菌gz-5菌株制剂的ph、悬浮率、及润湿性(润湿时间)。

4、芽孢杆菌可湿性粉剂质量检测结果

gz-5芽孢杆菌可湿性粉剂质量检测结果如表8所示，该制剂芽孢含量为3.5×10⁹cfu·g^-1，杂菌率0.08％，ph7.5，细度96.34％，干燥减量4.7％，润湿时间50s，悬浮率80.32％，其各项指标均符合相关国家标准(ny/t2293.1-2012)。

表8gz-5芽孢杆菌可湿性粉剂质量检测

试验例9可湿性粉剂的防效测定

称取1.0g实施例1-3可湿性粉剂加入一定量无菌水分别稀释50×、100×、200×，以备用。从田间采集新鲜大小一致还未成熟的番茄果实，用自来水冲洗果实表面后，用75％乙醇和3％的次氯酸钠进行表面消毒，并用无菌水冲洗干净，待晾干后接种不同浓度的制剂24h后接种番茄灰霉和番茄早疫病原菌菌块，7d后测量病原菌的直径，计算抑制率。以接种等量无菌水为空白对照，3次重复。室内果实离体防效测定结果见表9-11。

由表9可知实施例1可湿性粉剂对番茄果实具有一定的防治效果，随着浓度的降低，防治效果也随之下降。在不同稀释倍数的可湿性粉剂对番茄早疫和番茄灰霉防治效果最好的分别是87.9％和85.7％。可湿性粉剂对番茄早疫和番茄灰霉的防治效果见效果图1。

表9实施例1可湿性粉剂对2种病原菌的离体防效

由表10可知实施例2可湿性粉剂对番茄果实具有一定的防治效果，随着浓度的降低，防治效果也随之下降。在不同稀释倍数的可湿性粉剂对番茄早疫和番茄灰霉防治效果最好的分别是88.31％和86.62％。

表10实施例2可湿性粉剂对2种病原菌的离体防效

由表11可知实施例3可湿性粉剂对番茄果实具有一定的防治效果，随着浓度的降低，防治效果也随之下降。在不同稀释倍数的可湿性粉剂对番茄早疫和番茄灰霉防治效果最好的分别是77.90％和83.24％。

表11实施例3可湿性粉剂对2种病原菌的离体防效

结论与讨论

本发明以前期筛选出的对番茄灰霉、番茄早疫和番茄枯萎具有很好的抑制效果的拮抗菌株制备成了以gz-5芽孢杆菌为有效成分的可湿性粉剂。试验制备的gz-5芽孢杆菌可湿性粉剂的载体是硅藻土；分散剂为三聚磷酸钠，润湿剂为wp60，其比例是7：3，助剂加入量为14％；保护剂为黄原胶，稳定剂为羧甲基纤维素钠。所发明制备的芽孢杆菌可湿性粉剂具有芽孢含量高、稳定性较好，可明显提高其对植物病害的防治效果，室内防治效果测定表明，在番茄离体果实上的对番茄灰霉病和番茄早疫病防效分别可达85.7％和87.9％。

有关芽孢杆菌中可湿性粉剂的研究中发现有些生防菌株能够在培养过程中产生许多抑制植物病虫害的物质。而许多学者采用过滤或离心等方法收集菌体，再制备成悬浮液与相关的填料和助剂等成分混合制备可湿性粉剂，这些方法会使得菌株代谢的有效物质不能得到使用。因此，在制备芽孢杆菌可湿性粉剂的过程中将液体发酵的产物一起与其他填料及助剂混合制备相对高效的可湿性粉剂。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。