一种培养Steinernemacarpocapsae线虫的方法与流程

本发明属于昆虫病原线虫培养技术领域，具体的说，涉及一种培养s.carpocapsae线虫的方法。

背景技术：

昆虫病原斯氏属steinernema和异小杆属heterorhabditis线虫是国际上新型的高效生物杀虫剂(georgisetal.，2006)，从二十世纪30年代开始就被用于害虫的防治(smart，1995)，具有杀虫能力强，杀虫谱广，能主动搜索寄主，对人畜、环境安全等优点，易于大量培养及配制产品，并能与多种化学农药混用，对钻蛀及地下害虫有特效(kayaandgaugler1993；grewaletal.，2005；georgisetal.，2006；yanetal.，2013；颜珣等，2014)。

昆虫病原线虫的生活史起始于感染期幼虫(infectivejuveniles，ij)携带共生细菌进入寄主昆虫体内，感染期幼虫避开昆虫的免疫反应，在昆虫血淋巴内释放共生细菌(dowdsandpeters，2002)。共生细菌在昆虫血淋巴内增殖，杀死寄主昆虫，线虫取食共生细菌以繁殖。当昆虫体内营养耗尽，3龄耐受态感染期幼虫形成，在外界环境足够湿润且温度适宜时，感染期幼虫携带共生细菌离开寄主昆虫(brownandgaugler，1997)，搜寻新的寄主。感染期幼虫是昆虫病原线虫生活史中唯一能自由存活的龄期，可使用普通的喷雾器进行施用以防治害虫。感染期幼虫能存活1到多个月，可进行产业化培养(wrightetal.，2005)。

昆虫病原线虫的产业化培养是昆虫病原线虫推广及商业化应用的基础。昆虫病原线虫可以通过寄主昆虫进行体内培养，亦可以在体外通过固体培养基或用发酵罐进行液体培养。昆虫病原线虫的体外培养需要共生细菌的参与，共生细菌可将培养基中的营养物质转化成昆虫病原线虫生长发育繁殖所需的成分(dowdsandpeters，2002)。进行昆虫病原线虫的产业化培养时，液体培养是最合算的，但是固体培养和体内培养同样重要，固体培养在劳动力便宜的国家和地区更为适用，因为所需要的前期投入少；体内培养则适合于实验室内种质保存及小量实验。

技术实现要素：

为了克服背景技术中存在的问题，本发明提供了一种培养s.carpocapsae线虫的方法，不但可使s.carpocapsae线虫完成世代交替，其能够更快更高效的恢复感染期幼虫，且其生长速度较快，为线虫的快速、高效培养商品化提供了条件。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的培养steinernemacarpocapsae线虫的方法，具体包括以下步骤：

1)将柞蚕蛹血淋巴、海藻糖、鸡蛋黄、脱脂奶粉、n’s盐溶液和水进行调配、混匀，得到人工卵液；

2)将s.carpocapsae感染期幼虫接种到人工卵液中，感染期幼虫恢复生长成成虫，成虫怀卵，卵孵化成一龄幼虫、再生长经过二龄幼虫、三龄幼虫、四龄幼虫，然后再生长得到第二代成虫。

作为优选，人工卵液每9ml通过以下方法配制获得：将柞蚕蛹血淋巴3ml，无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水2.5ml混合均匀。

作为优选，每升n’s盐溶液的配方如下：nacl7.5g/升，kcl0.1g/升，cacl20.2g/升，nahco30.2g/升，余量为水。

作为优选，s.carpocapsae感染期幼虫是s.carpocapsaeall感染期幼虫。

第二代的成虫可以继续培养，如此循环往复，完成世代交替。

本发明的有益效果：

本发明采用人工卵液作为孵育液培养s.carpocapsae感染期幼虫，其发育较快，3d可以观察到成虫怀卵。本发明的培养s.carpocapsae线虫的方法不但可使s.carpocapsae线虫完成世代交替，相比于柞蚕蛹血淋巴，其能够更快更高效的发育到怀卵成虫阶段，为线虫的快速高效培养提供了条件。

附图说明

图1是实施例1与对比例1-2中线虫恢复情况对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

实施例1

1)昆虫病原线虫：s.carpocapsaeall，从大蜡螟虫尸中收集感染期幼虫(infectivejuveniles，ij)，过滤去除死虫，调整线虫浓度为1000ij/ml，15℃，100rpm保存备用。测定前在25℃左右的室温下将线虫浓度浓缩为20000ij/ml。

2)人工卵液的制备：将柞蚕蛹血淋巴3ml，无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水2.5ml混合均匀，-20℃保存备用(n’s盐溶液：将nacl7.5g，kcl0.1g，cacl20.2g，nahco30.2g加入到1000mlh2o中，121℃，10⁵kpa高压灭菌30min，室温保存备用)；

3)在384孔板的每个孔内加入4μl孵育液，每孔加入2μl浓度为20000ij/ml的线虫液(含约40条感染期线虫)，进行恢复培养。

对比例1

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为柞蚕蛹血淋巴。

柞蚕蛹血淋巴的制备：剪开茧，取出柞蚕蛹，65℃水浴10min，75％酒精涂擦蛹表消毒后，在超净工作台内剪开蛹尾部，挤出收集血淋巴，-20℃保存备用；

对比例2

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为柞蚕蛹血淋巴水混合液。

柞蚕蛹血淋巴水混合液的制备：将柞蚕蛹血淋巴3ml和无菌水6ml混匀，现配现用。

对比例3

步骤与实施例1相同，不同的是孵育液为基础液。

基础液的制备：将无水海藻糖0.1g，鸡蛋黄2.5ml，脱脂奶粉0.1g，n’s盐溶液1ml和无菌水5.5ml混合均匀，-20℃保存备用(n’s盐溶液：将nacl7.5g，kcl0.1g，cacl20.2g，nahco30.2g加入到1000mlh2o中，121℃，10⁵kpa高压灭菌30min，室温保存备用)。

实验分析

每个取样时间6个孔，每天取样，连续取样7天，每种线虫每个处理42孔。在计数板内加入水，将每个孔的线虫吸取到计数板的每个孔内，镜检，记录每个孔内死亡线虫、存活线虫的总数量，同时记录恢复的线虫数量。

s.carpocapsaeall在基础液中不恢复不发育。s.carpocapsaeall感染期幼虫在3种孵育液(人工卵液、柞蚕蛹血淋巴、柞蚕蛹血淋巴水混合液)中的恢复发育情况见图1和表1。

表1.steinernemacarpocapsaeall线虫在3种孵育液中恢复和发育的时间

s.carpocapsaeall线虫在人工卵液中1d可恢复，3d可以观察到成虫怀卵。s.carpocapsae在人工卵液中出小虫及行成第2代怀卵成虫所需的时间略长于在柞蚕蛹血淋巴和柞蚕蛹血淋巴水混合液中的时间。

本发明的方法只需要少量的柞蚕蛹血淋巴与其他物质相配合，相比于柞蚕蛹血淋巴，其能够更快更高效的发育到怀卵成虫阶段，并且经试验证明，本发明的人工卵液在-20℃保存一个月，其效果与刚刚配制的效果一样好。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。