一种文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法与流程

本发明涉及木本经济作物培育
技术领域：
，尤其涉及一种文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法。
背景技术：
：文冠果(xanthocerassorbifoliumbunge)属无患子科(sapindaceae)文冠果属(xanthocerasbunge)的多年生落叶灌木或小乔木，单种属，它原产于我国北方黄土高原地区，天然分布于北纬32°～46°，东经100°～127°，即北到辽宁西部和吉林西南部，南自安徽省萧县及河南南部，东至山东，西至甘肃、宁夏。集中分布在内蒙、陕西、山西、河北、甘肃等地，辽宁、吉林、河南、山东等省均有少量分布。文冠果耐干旱、贫瘠、抗风沙，在石质山地、黄土丘陵、石灰性冲积土壤、固定或半固定的沙区均能成长，是我国特有的一种优良木本食用油料树种，文冠果适应在草沙地、撂荒地、多石的山区、黄土丘陵和沟壑等处，甚至在崖畔上都能正常生长发育。文冠果种子是生产生物柴油的优质原料，被列为国家重点保护树种，对发展农场经济林产业，增加农民收入有很重要的意义。种子中油质营养丰富，种仁含油率高，木材坚硬，纹理美观可做家具。文冠果的收益快，寿命长，用途广。文冠果“全身是宝”是“一年种百年收的铁杆庄稼”。文冠果药用价值、经济价值、生物柴油、保健食品的开发及景观价值、防风固沙、小流域治理和荒漠化治理方面的应用，对文冠果种苗的需求量急剧增加，近些年，该树种成为北方地区环境治理、生态修复和精准扶贫的首选物种。但文冠果种子具有后熟性休眠和坚硬的种皮，且存在发芽口障碍，在实生苗培育和种子发芽实验中存在很大障碍。种子生活力是种子生命的基本特征，种子发芽的潜在能力是种子生活力的表现形式，种子生活力对预测休眠种子的发芽力和快速预测种子发芽率具有重要意义。由于文冠果种子具有特殊的休眠特性，种皮坚硬，现有ttc染色法、红墨水染色法、溴麝香酚蓝染色法，靛蓝洋红染色法和离体胚培养法等无法对文冠果种子生活力进行准确测定且重复性差。技术实现要素：1.需要解决的技术问题本发明的目的在于，提供一种文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，采用水中吸胀软化种皮，机械剔除外种皮，带内种皮芽床(砂床和纸床)培养的方法，测定种子生活力，并描述了种子生活力鉴定标准，为进一步了解文冠果种子萌发特性提供科学依据。2.技术方案为了实现上述目的，本发明的技术方案是：一种文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，包括如下步骤：步骤1，净度处理步骤：将文冠果种子清选并过筛得到净种子；步骤2，分取试验样品：从步骤1净度处理的净种子中，随机取试验样品500粒，分成4次重复，每个重复125粒种子；步骤3，试样预湿：将步骤2分取的四个重复的试验样品，放入烧杯，在15℃-25℃的水中浸泡8-12小时；步骤4，机械去除外果皮：将步骤3预湿的种子样品，用钳子和镊子夹压，机械取除外种皮，留内种皮和胚，不要损伤胚。对于取外种皮后出现的干瘪、变色、发霉或空秕种子，按照死种子对待，计算种子死亡率；步骤5，离体胚培养：将步骤4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，用湿润的纸床或砂床，在15℃、20℃或25℃的条件下，培养3-5天，得到培养后种仁；步骤6，生活力鉴定：从步骤5培养后的种仁中，挑选出萌发的、种仁吸胀未萌发但保持坚硬的、内种皮破裂种仁呈现乳白色或略带灰褐色的、体积稍有增大种仁，作为有生活力的种子，水肿的、霉变的、腐烂种子为死种子，并计算有生活力种子的百分率。优选的是，步骤3的试样预湿采用水中预湿法，将试样所有重复都放入烧杯，在15～25℃蒸馏水浸泡8-12小时，使外种皮软化，种仁吸水富于弹性，但不能完全吸胀，保持外种皮与种仁的空隙，使外种皮去除顺利，减少对种仁的机械损伤。优选的是，步骤4中，将预湿的种子样品用钳子夹压发芽口，用镊子将外种皮从胚根位置剔除，留内种皮且不损伤胚。优选的是，步骤4中的种子死亡率按照如下公式计算：百分率(％)＝(种子死亡率)/供培种子数×100％优选的是，步骤6中的生活力种子的百分率按照如下公式计算：优选的是，步骤5中的纸床为种子专用发芽纸，优选的是，hl3-600型发芽纸。优选的是，步骤5中的砂床为过0.05-0.8mm筛、140-145℃下杀菌2小时的清水河沙。3.有益效果综上所述，本发明的有益效果在于：(1)提供了一种用离体胚培养法对文冠果种子进行生活力测定的方法，该离体胚培养方法测定工艺，是利用水中预湿的物理方法软化种皮，并使种仁富有韧性，用机械法去除外种皮，破除种子硬实，使带内种皮种仁在尽量减少损伤状态下快速取出，在气候箱内采用纸床或砂床离体培养的一种技术；(2)这种方法可直接根据培养后种仁状态判断种子生活力，相较其他方法，简便易行，原理可靠，无化学损伤，机械损伤小，可重复性好，省时省工，成本低廉；采用水中预湿机械去除外种皮法，文冠果种仁损伤率小于5％，硬实破除率100％，文冠果种子的生活力为95％-98％；文冠果种仁经离体胚培养，可判断种子休眠状态，以便采取适宜措施，破除种子休眠，提高种子发芽率。附图说明图1实施例1-6处理文冠果种子生活力表现图。图2对比例1-6处理文冠果种子生活力表现图。具体实施方式结合具体实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，种子批来自甘肃省张掖市祁连山水源涵养林研究院文冠果基地，包括如下步骤：步骤1，净度处理：用5mm的筛子筛选，剔除杂质和其他植物种子，得到文冠果净种子；步骤2，分取试验样品：从步骤1净度处理的净种子中，随机取试验样品500粒，分成4次重复，每个重复125粒种子；步骤3，试样预湿：将步骤2分取的四个重复的试验样品，放入烧杯，在15℃-25℃的水中浸泡12小时；步骤4，机械去除外果皮：将步骤3预湿的种子样品，用钳子夹压，机械取除外种皮，留内种皮和胚，不要损伤胚。对于取外种皮后出现的干瘪、变色、发霉或空秕种子，按照死种子对待，计算种子死亡率；步骤5，培养砂准备：将河砂过0.05-0.8mm的筛子，用清水淘洗后，在140-145℃下杀菌2小时，将消毒砂与蒸馏水按照85：15(w:v)的比例混匀，堆闷1小时；步骤6，离体胚培养：将湿润的培养砂装入发芽盘，压实，厚度3-4cm，将步骤4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以砂上方式置床(种子三分之二压入砂中，三分之一外露)，在25℃光照，rh值90-100％的条件下培养5天，得到培养后种仁；步骤7，生活力鉴定：从步骤6培养后的种仁中，挑选出萌发的、种仁吸胀未萌发但保持坚硬的、内种皮破裂种仁呈现乳白色或略带灰褐色的、体积稍有增大种仁，作为有生活力的种子，水肿的、霉变的、腐烂种子为死种子，计算有生活力种子的百分率。测定结果：文冠果种子的生活力为97％(请参见附图1)。实施例2本实施例中一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，样品来自内蒙，步骤1和步骤2与实施例1相同；步骤3，试样预湿：将步骤2分取的四个重复的试验样品，放入烧杯，在15℃-25℃的水中浸泡8小时；步骤4，机械去除外果皮：将步骤3预湿的种子样品，用镊子夹压，机械取除外种皮，留内种皮和胚，不要损伤胚。对于取外种皮后出现的干瘪、变色、发霉或空秕种子，按照死种子对待，计算种子死亡率；步骤5，培养砂准备：,将河砂过0.05-0.8mm的筛子，用清水淘洗后，在140-145℃下杀菌2小时，将消毒砂与蒸馏水按照90：10(w:v)的比例混匀，堆闷1小时；步骤6，离体胚培养：将湿润的培养砂6装入发芽盘，压实，厚度2-3cm，将步骤4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以砂上方式置床，在种子上盖1-2cm后的湿润培养砂，在30℃光照，rh值90-100％的条件下培养3天，得到培养后种仁进行；步骤7，生活力鉴定：用3-5mm的筛子将发芽盘中的种子筛出，挑选出萌发的、种仁吸胀未萌发但保持坚硬的、内种皮破裂种仁呈现乳白色或略带灰褐色的、体积稍有增大种仁，作为有生活力的种子，水肿的、霉变的、腐烂种子为死种子，计算有生活力种子的百分率。测定结果：来自内蒙的文冠果种子生活力为98％(请参见附图1)。实施例3一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，种子批来自甘肃省景泰县西北文冠果基地，步骤1和步骤2与实施例1相同；步骤3，试样预湿：将步骤,2分取的四个重复的试验样品，放入烧杯，在15℃-25℃的水中浸泡10小时；步骤4，机械去除外果皮：将步骤3预湿的种子样品，用镊子夹压，机械取除外种皮，留内种皮和胚，不要损伤胚。对于取外种皮后出现的干瘪、变色、发霉或空秕种子，按照死种子对待，计算种子死亡率；步骤5，培养纸床床准备：将专用发芽纸(美国，anchorpaper)，在发芽盘中用蒸馏水浸泡，2-3小时，使发牙床水分饱和；步骤6，离体胚培养：将湿润的发芽床铺平，将步骤4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以纸卷方式置床，把纸卷卷住，用橡皮筋扎住纸卷，将纸卷装入保湿透气塑料袋，在20℃培养箱内培养5天，得到培养后种仁；步骤7，种子生活力鉴定规则与实施例1相同。测定结果：甘肃省景泰县西北文冠果种子的生活力为98％(请参见附图1)。实施例4一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，种子批来自陕西杨凌种子市场，步骤1至步骤4与实施例3相同；步骤5，培养纸床准备：将发芽纸(普通滤纸)，剪裁成发芽盒大小，用2-3层在发芽盒中用蒸馏水预湿，沥去多余水分；步骤6，离体胚培养：将步骤5机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以纸上方式置床，在种子上盖一层盒底相同大小的湿润发芽纸，盖上发芽盒盖，在20℃培养箱内培养5天，得到培养后种仁；步骤7，种子生活力鉴定规则与实施例1相同。测定结果：陕西杨凌种子市场的文冠果种子的生活力为98％(请参见附图1)。实施例5一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，种子批来自张掖市甘州区红沙窝场，步骤1至步骤5与实施例4相同；步骤6，离体胚培养：将步骤,4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以纸上方式置床，盖上发芽盒盖，在25℃培养箱内培养3天，得到培养后种仁；步骤7，种子生活力鉴定规则与实例1相同。测定结果：张掖市甘州区红沙窝场文冠果种子的生活力为98％(请参见附图1)。实施例6一种珍稀木本经济作物文冠果种子生活力测定的带内种皮离体胚培养方法，种子批来自张掖市甘州区红沙窝场，步骤1至步骤5与实施例5相同；步骤6，离体胚培养：将步骤,4机械去除外种皮，留内种皮的完整种胚，以纸上方式置床，盖上发芽盒盖，在30℃培养箱内培养3天，得到培养后种仁；步骤7，种子生活力鉴定规则与实例1相同。测定结果：张掖市甘州区红沙窝场文冠果种子的生活力为98％(请参见附图1)。对比例1本对比例与实施例1中方法相似，区别在于步骤4中机械去除外果皮处理、染色处理和鉴定方法，具体操作为：去除果皮：将步骤4预湿的种子样品，用钳子夹压，取除外种皮，用镊子去掉内种皮，使胚外露；染色处理：从种子中取出种仁，用0.1％的hgcl2消毒2min，用0.5％的ttc溶液黑暗条件下35℃染色3-5h；生活力鉴定：染色处理后的种仁中，挑选出被ttc染成均匀红色的种子作为有生活力的种子，不染色或染色不匀称的种子为死种子。测定结果：文冠果种子的生活力为34％，种子死亡率为66％(请参见附图2-a)。对比例2本对比例与对比例1中方法相似，区别在于染色处理和鉴定方法，具体操作为：去染色处理：从种子中取出种仁，用0.1％的hgcl2消毒2min，将种仁置于0.1％的溴麝香草酚蓝(btb)琼脂凝胶薄层培养皿中，加盖后置于30℃的恒温箱中培养5h；生活力鉴定：染色处理后的种仁中，挑选出因呼吸使种仁变成橙色或黄色的种子作为有生活力的种子，不染色或染成蓝色的种子为死种子。测定结果：文冠果种子的生活力为48％，种子死亡率为52％(请参见附图2-b)。对比例3本对比例与对比例1中方法相似，区别在于染色处理和鉴定方法，具体操作为：去染色处理：从种子中取出种仁，用0.1％的hgcl2消毒2min，将种仁用5％的红墨水在35℃下染色20min，倒去红墨水后用水冲洗至溶液无色；生活力鉴定：染色处理后的种仁中，挑选不染色种仁作为有生活力的种子，染成红色的种子为死种子。测定结果：文冠果种子的生活力为40％，种子死亡率为60％(请参见附图2-c)。对比例4本对比例与对比例1中方法相似，区别在于染色处理和鉴定方法，具体操作为：去染色处理：从种子中取出种仁，用0.1％的hgcl2消毒2min，用2％的靛蓝洋红在35℃下染色20min，倒去靛蓝洋红后用水冲洗至溶液无色；生活力鉴定：染色处理后的种仁中，挑选不染色种仁作为有生活力的种子，染成蓝色的种子为死种子。测定结果：文冠果种子的生活力为62％，种子死亡率为38％(请参见附图2-d)。对比例5本对比例与对实施例5中方法相似，区别在于去果皮处理和离题胚培养方法，具体操作为：去除果皮：将步骤4预湿的种子样品，用钳子夹压，取除外种皮，用镊子去掉内种皮，使胚外露；离题胚培养：将去果皮种仁以纸上方式置床，放入直径15cm在培养皿内，在25℃培养箱内光照条件下培养3天，得到培养后种仁；鉴定方法与实施例1相同。测定结果：文冠果种子的生活力为82％，种子死亡率为18％(请参见附图2-e)。对比例6本对比例与对对比例5中方法相似，区别在于离题胚培养温度，具体操作为：离题胚培养：将去果皮种仁以纸上方式置床，放入直径15cm在培养皿内，在20℃培养箱内光照条件下培养5天，得到培养后种仁；鉴定方法与实施例1相同。测定结果：文冠果种子的生活力为90％，种子死亡率为10％(请参见附图2-f)。实施例和对比例的文冠果种子生活力百分率和种子死亡率如表1所示。表1不同测定方法文冠果种子生活力结果比较方法生活力(％)死亡率(％)实施例1973实施例2982实施例3982实施例4982实施例5982对比例13466对比例24852对比例34060对比例46238对比例58218对比例69010以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效结构变换，或直接或间接运用附属在其他相关产品的
技术领域：
，均同理包括在本发明的专利保护范围内。当前第1页12