一种防治果树轮纹病的复方生物农药制剂的制作方法

本发明属于生物农药领域，涉及一种复方茶枯防治苹果和梨等果树轮纹病的生物农药制剂生产方法及应用。

背景技术：

苹果和梨是世界范围内深受消费者喜爱的水果之一，中国是世界上苹果和梨的最大生产国，目前，我国苹果种植面积和总产量都位居世界第一。梨的栽培面积、产量、出口量及品种数量等也均居世界前列，在我国，梨仅次于苹果、柑橘，位居第三。

轮纹病也叫瘤皮病、粗皮病，是我国苹果、梨产区一种严重的病害，在世界各地的产梨区也都很常见，对苹果、桃、李、杏等树种也有一定的危害，尤其是高温、高湿和沿海果产区更为严重，有的年份田间病果率可达70％-80％，个别果园发病株率高达80％以上，是影响国内果树种植业的关键病害。轮纹病菌主要危害果树果实、枝干和叶片，尤其会使果实腐烂，对水果的质量产生了非常大的影响。

苹果、梨轮纹病的致病菌属于同一个种，轮纹病病原有性态是botryosphaeriadothidea，属子囊菌，无性态为树壳梭孢菌(fusicoccumaesculi)。轮纹病菌侵染梨或苹果，引起果实轮纹烂果，轮纹病菌(macrophomakuwatsukaihara)是苹果和梨等果业重要病害轮纹病的病原真菌。

发病症状大多表现在枝干受害，起初以皮孔为中心形成暗褐色水渍状斑，围绕着皮孔扩散，形成扁圆形的褐色小点，呈圆形或扁圆形，中心隆起，呈瘤状，并且材质坚硬。然后长出的病斑进一步扩大，病斑周缘凹陷，感染部位与未被感染部位交界的地方逐渐分裂，颜色变青灰至黑褐色，翌年产生分生孢子器，出现黑色点粒。随树皮愈伤组织的形成，病斑四周隆起，病健交界处发生裂缝，病斑边缘翘起如马鞍状，数个病斑连在一起，形成不规则大斑，严重时，病树长势衰弱，枝条枯死。果实发病多在近成熟期和贮藏期，受感染部位会大面积发病，受感染的果实在发病一开始表现为斑渍状小圆点。圆点中心有皮孔，初以皮孔为中心形成褐色水渍状斑，渐扩大，呈暗红褐色至浅褐色，具清晰的暗褐色同心轮纹，等病斑生长扩大后，整个受感染部位会形成轮纹。感染部位腐烂软化，逐渐恶化可致全果腐烂，发出酸臭味，并渗出茶色粘液，病果渐失水成为黑色僵果，表面布满黑色粒点。果树的叶子感染初期则会产生形状不规则的灰褐色病斑，轮纹明显，一段时间后病斑逐渐变为灰色，并会在病斑表面生长出黑色小点，导致果树叶片提前凋落等现象。

长期以来，防治轮纹病的手段主要有合理选择抗病品种或无病苗木；加强果园管理，增强树势，增施磷肥、饲肥，控制氮的用量；冬季和早春萌芽前，精细刮除病皮、病瘤等病组织；套袋防病等。在加强管理的基础上，进行药剂防治，其中化学农药凭借其防治效果好，见效快，杀菌谱广，低成本和使用方便等特性成为使用范围最广的一种手段。国内学者在轮纹病防治方面陆续开展了大量研究工作，并取得了很好的结果。袁自更从田间管理、药剂防治及果实储藏等方面详细论述了苹果轮纹病的防控措施。迟福梅等通过室内杀菌剂毒力试验表明，10％苯醚甲环唑微乳剂对苹果轮纹病病原菌的抑菌效果最佳，其次为43％戊唑醇悬浮剂。叶长飞等用福星乳油(有效成分为氟硅唑)、世高水分散粒剂(有效成分为苯醚甲环唑)、阿米西达悬浮剂(有效成分为嘧菌酯)、翠贝干悬浮剂(有效成分为醚菌酯))、阿米妙收悬浮剂(有效成分为苯甲嘧菌酯)、甲基托布津可湿性粉剂和多菌灵可湿性粉剂等7种药剂进行防治梨轮纹病，取得了良好的效果。目前，国内果树轮纹病的用药方法一般采用喷施波尔多液、代森锰锌、多菌灵、甲基硫菌灵、拓福、晋诺等化学药剂。

长期使用化学农药会出现药物成分毒性大，残留时间长，不易降解、环境破坏、病菌产生抗药性、破坏植物体内外环境的平衡等危害。随着人们环保意识的不断增强及对食品安全问题的关注，以及对农药残留、病原菌抗药性等问题认识的加深，越来越多的研究者开始致力于寻找和开发安全高效的生物农药。赵白鸽等从苹果树皮上分离获得的一种枯草芽孢杆菌b-903，其对离体的苹果轮纹病菌株有明显的抑菌效果，经田间喷淋保护和水果贮前浸果处理结果表明，该菌株对轮纹病菌有明显的抑制作用。纪兆林等从土壤中分离获得的地衣芽孢杆菌w10，对苹果轮纹病菌的抑制及防效试验结果表明，w10菌液、培养滤液、抗菌蛋白对病菌的形态、菌丝生长、产孢和分生孢子的萌发都具有明显的破坏或抑制作用。分离筛选获得的拮抗细菌no.1和生防放线菌等也均对轮纹病菌有很好的拮抗作用，而且生防菌与nahco3协同作用可提高生防菌对轮纹病采后防治的效果。同时，苦参碱提取物及植物内生代谢物鲍曼菌素等植物源农药也对轮纹病有较好防效。

植物是抗菌活性物质的天然宝库。目前真正投入应用的植物抗菌剂为数不多，有茶多酚、大蒜素对病菌孢子萌发和菌丝生长有很强的抑制作用，在防治甘薯病害、棉花苗期病害和油菜病害等方面有较好效果；香芹酚是从唇形科植物百里香芳香油中分离出来的具有杀菌活性的植物源抗菌剂，用于防治苹果、桃、梨、柑桶、花生、棉花的曲露病及果实、薯块的木霉病；大豆卵磷脂来源于大豆油，能使白粉病芽孢粗短，菌丝伸长延续缓慢，推迟形成分生孢子梗，分生孢子亦不能飞散传播，大豆卵磷脂可防治瓜类、茄子等蔬菜的白粉病，且该类化合物对人、畜非常安全；活化酯(离体条件下不表现出明显的杀菌活性，但能诱导作物产生抗菌免疫功能)和由植物次生代谢产生的结构各异的具有光敏杀菌作用的化合物，包括呋喃香豆素类、聚乙炔类、噻吩类、生物碱类和醌类等。

植物源抗果树轮纹病菌活性成分因系植物次生代谢物质，施用后易于降解，环境相容性好；具有多种新颖独特的化学结构，形成双位点甚至多位点的作用方式，使病害难以形成抗药性等。但植物源农药往往存在活性较低、药效维持时间短、生产成本高等缺点。

本发明所要解决的技术问题是：提供一种生物农药复配制剂的生产方法，用于防治果树轮纹病，该方法制备的生物农药是以茶枯等天然原料为主要原料经科学加工而成，该农药对人畜无毒无害，对环境友好，可替代目前使用的化学、化工合成农药，应用广泛，也可满足对其他农作物、果木、蔬菜、花卉的杀菌、除害的需求。

茶枯也叫茶麸、茶籽饼，颗粒呈紫褐色，是油茶果经榨油后剩下的油茶果壳渣饼。茶枯中的茶皂素含量很高，抑制或杀灭多种植物病原真菌，在农作物传染病害的防治方面具有良好的作用，此外，还能够避免作物出现农药残留造成的污染，很好的提高作物产量和品质。油茶是我国目前主要的油料植物之一，每年生产油茶籽约100万t、榨油后的副产物——油茶粕约68万t，因此对这些农业产品加工的下脚料进行再利用，也具有可持续发展的生态意义。

技术实现要素：

本发明的目的就是要提供一种用于防治果树轮纹病的以茶枯为主的纯天然复方生物农药制剂及其制备方法应用方法，该生物农药便于生产操作，高效、低毒，环境友好易降解，不易产生抗药性等特点。

茶枯、茶叶、黄藤根或茎、木荷叶片、厚朴叶、律草、银杏叶等植物材料置于烘箱70℃烘至恒重，然后称取茶枯50-100重量份、茶叶20-30重量份、木荷叶片20-30重量份、厚朴鲜叶7-10重量份、律草20-30重量份、银杏叶7-10重量份混合后粉碎，过40目筛，脱脂，再加入70％乙醇浸提3次，每次浸提8-12小时，分别经乙醇回流浸提、过滤、减压浓缩，冻干等操作得到粗提干粉，即为复方茶枯生物农药主效成分。

黄藤根或茎粉碎成粗粉，加0.2％硫酸溶液浸提3次，每次浸提8-12小时，过滤，收集滤液，滤液加7％含碘盐盐析得到粗提干粉。

将复方茶枯生物农药主效成分与黄藤根或茎粗提干粉按10∶1-5∶1混合，在40～50℃下低速搅拌，混合制得成品，于密闭、避光条件下保存或运输。

复方茶枯生物农药制剂的特点是以茶枯、茶叶、黄藤根或茎、木荷叶片、厚朴叶、律草、银杏叶提取物为主要杀菌成分，制成可湿性粉剂。

本发明提供的治疗果树轮纹病的药物施用方法是兑水喷雾或刷涂树干，复方茶枯生物农药制剂兑水的比例为1∶200-500。刷涂树干的药量为复方茶枯生物农药100g兑水10-30kg，刷涂树干。叶面和树枝喷施的用量为每次每亩喷施兑水稀释后的生物农药5-10kg。

技术效果

本发明具有如下优点：

1、对苹果和梨等果树轮纹病菌具有高效抗病活性。复方茶枯抗轮纹病菌制剂能有效地抑杀苹果和梨等果树轮纹病菌丝生长和孢子萌发而控制其漫延扩散，抑制率在80％以上，如图1和图2所示。另外该制剂对苹果黑星病、桃褐腐病等也具有效防治作用。

2、病菌难以产生抗药性。复方茶枯抗轮纹病菌制剂是一种纯天然、植物源制剂，同时其组分复杂，轮纹病菌对其难以产生抗药性。

3、环保、低毒。复方茶枯抗轮纹病菌制剂的主要化学活性成分为植物生长过程中产生的次生代谢物质，易于在环境中降解。

4、生产原料广泛，价格低廉，可持续发展。便于资源综合利用，适合规模生产。本制剂所用的植物是茶枯、茶叶、黄藤根或茎、木荷叶片、厚朴叶、律草、银杏叶，这几种植物在我国有较为广泛的分布。另外，茶枯和茶叶均为油料或茶利用后的林业副产物和下脚料。

5、采用醇浸提后所得到茶枯、茶叶、黄藤根或茎、木荷叶片、厚朴叶、律草、银杏叶等的生产废渣可用于生产有机肥料，既环保，又有利于废物利用。

6、该工艺过程中的溶剂、洗脱剂均可重复使用，工艺成本低，易于工业化生产。

附图说明

图1为不同浓度油茶粕提取物溶液对梨轮纹病菌生长的抑制作用图，图中a，b，c，d，e，f，g分别表示油茶粕提取物浓度为0mg/ml，5mg/ml，6.6mg/ml，10mg/ml，13.3mg/ml，15mg/ml，20mg/ml。

图2为茶粕提取物对梨轮纹病菌菌丝处理结果图，其中ck，a，b，c，d分别表示油茶粕提取物浓度为0mg/ml，5mg/ml，10mg/ml，15mg/ml，20mg/ml。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以下实施例旨在说明本发明而不是对本发明的进一步限定。

实施例1

茶枯、茶叶、黄藤根或茎、木荷叶片、厚朴叶、律草、银杏叶等植物材料置于烘箱70℃烘至恒重，然后称取茶枯50-100g、茶叶20-30g份、木荷叶片20-30g、厚朴鲜叶7-10g、律草20-30g、银杏叶7-10g混合后粉碎，过40目筛，脱脂，再加入1500-2000ml70％乙醇浸提3次，每次浸提8-12小时，分别经乙醇回流浸提、过滤、减压浓缩，冻干等操作得到粗提干粉，即为复方茶枯生物农药主效成分。

黄藤根或茎粉碎成粗粉，加0.2％硫酸溶液浸提3次，每次浸提8-12小时，过滤，收集滤液，滤液加7％含碘盐盐析得到粗提干粉。

将复方茶枯生物农药主效成分与黄藤根或茎粗提干粉按10∶1-5∶1混合，在40～50℃下低速搅拌，混合制得成品，于密闭、避光条件下保存或运输。

药物兑水的比例为1∶200-500。

实施例2

取实施例1所得的复方茶枯生物农药主效成分，按提取质量梯度稀释为5mg/ml、6.6mg/ml、10mg/ml、13.3mg/ml、15mg/ml、20mg/ml，以菌丝生长速率法测定提取物对果树轮纹病菌丝体生长的抑制率。在灭菌培养皿中分别加入6个浓度梯度的制剂各1ml，对照组加等量无菌水，各培养皿中分别倒入适宜温度(手长时间接触不烫手即可)的psa培养基9ml，立即轻轻摇匀，待凝固。用打孔器在培养5大生长旺盛的果树轮纹病菌菌落边缘打取菌圆片(直径9mm)，各挑取一块移入相应平板中，将有菌丝的一面翻转朝下倒扣在培养基表面，镊子稍稍按压使贴紧，置于28℃恒温箱中培养5d，每组处理3个重复。每天观察各处理组的菌落直径，并用十字相乘法测量记录并摄影，直至对照组几近长满培养皿时停止观察。

结果如图1所示，从图1可以看出复方茶枯制剂对轮纹病菌菌丝的生长有非常明显的抑制作用，随着制剂溶液浓度的增大，对轮纹病菌的抑制效果也增强，0～10mg/ml的抑菌效果增长幅度为最大，当浓度在6.6mg/ml时，抑制率即达到70％，超过13.3mg/ml时，抑菌效果增长幅度变小，抑制率约为83％，在20mg/ml处理组中，抑菌率达到最大。随着培养天数的延长，在低浓度复方茶枯制剂溶液处理组中，轮纹病菌仍然在很缓慢的生长，对轮纹病菌的的抑菌效果有些许的减弱，抑制率呈下降趋势；而高浓度复方茶枯制剂溶液处理组中轮纹病菌虽然也在生长，但是抑制效果则是继续加强，抑菌效果较好，在第五天的20mg/ml处理组中，抑制率达到最大，为86.54％。其中，13.3mg/ml处理组的浓度不高并且抑菌效果比较平稳，几天的抑菌效果均在80％以上，这表明13.3mg/ml浓度的复方茶枯制剂对轮纹病菌有良好的抑制效果。

实施例3

取实施例1所得的复方茶枯生物农药主效成分，按提取质量梯度稀释为20、15、10、5和0mg/ml共5个浓度梯度，混匀。用打孔器在培养好的真菌培养皿上打孔，在每个试管中各加入一片菌圆片，于28℃培养三天。取菌丝涂片，放干后立即番红复染液染色，显微镜下观察。每组处理3个重复。显微观察处理的菌丝生长形态(图2)。

图2显示，在对照组(ck)中，菌丝生长完好，无明显异常情况；处理组中，随着油茶粕提取物溶液浓度的升高，菌丝逐渐出现肿胀，断裂等现象；尤其是在20mg/ml处理组，菌丝断裂成大小不一的小段。由此可以表明，复方茶枯生物农药不仅可以抑制菌丝生长的伸长和萌发，也可导致菌体裂解，导致原生质外泄。