本发明属于农用杀菌剂领域，具体涉及一种多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的杀菌组合物。
背景技术：
：多粘类芽孢杆菌是一类重要的根际有益细菌，兼具促进植物生长和生物防治的作用,在生物医药、流程制造、生物修复等方面有重要利用。多粘类芽孢杆菌可产生多种生物活性物质,如酶、抗菌物质、植物生长调节剂等,多是蛋白质、多糖、多肽。多粘类芽孢杆菌以芽孢形式存在，耐温性好，具有“以菌治菌”的作用，且药效持久，不仅是防治青枯病、枯萎病、根腐病、软腐病等土传病害最理想的药剂，而且具有明显的促进生长、提高产量、改善品质的作用；无任何药害和残留，是无公害、绿色、有机蔬菜生产的首选微生物制剂。由于生物制剂类农药产品普遍存在速效性不强、应用的菌株生物活性不高或贮存过程中菌株易于消解等因素，往往导致应用效果差。多粘类芽孢杆菌目前在我国应用并不多，已登记的制剂产品仅8个，其中与井岗霉素复配的产品1个。本发明人通过大量试验筛选出了多粘类芽孢杆菌dn-1，对多种病原物具有显著的拮抗作用，其中对油茶炭疽病防效可达77%；对水稻纹枯病防效可达75%；其发酵产物也具有显著的抑菌作用。春雷霉素是由春日链霉菌所产生的氨基糖苷类抗生素，自研发以来，在亚洲和南美洲广泛应用于农业生产，对水稻稻瘟病防效较好，对马铃薯、黄瓜、芹菜、高粱、辣椒、菜豆等多种作物上病害都有较好的防治效果。目前在我国登记的产品已达100余种，用于水稻、烟草等及多种果树作物病害防治。技术实现要素：本发明分别采用稀释平板法分离和平板对峙法筛选，获得一株对灰梨孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢等多种真菌具有显著抑制作用的多粘类芽孢杆菌dn-1，并在此基础上提供了一种该多粘类芽孢杆菌和春雷霉素的新型杀菌组合物，对水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病具有较好的防治效果，利用多粘类芽孢杆菌dn-1芽孢、发酵产物中抗菌物质和春雷霉素协同作用，极大提高了防治效率。本发明提供的杀菌组合物其中有效成分均为生物或生物源农药，专利产品转化和推广后能大量减少化学农药的使用，同时两种有效成分的复配扩大了药剂防治谱，减少用药次数，从而实现经济、高效、环保的发明目的。本发明的技术方案如下：采用稀释平板法从土壤中分离多株细菌，利用平板对峙法，测定它们对灰梨孢、尖孢镰刀菌、灰葡萄孢等真菌的抑制活性，获得具有显著抑菌效果的多粘类芽孢杆菌。通过形态学及种水平保守基因16srdna序列相似性进行鉴定，并命名为多粘类芽孢杆菌dn-1。序列如下：tctaactaacctagcggcggacgggtgagtaacacgtaggcaacctgcccacaagacagggataactaccggaaacggtagctaatacccgatacatccttttcctgcatgggagaaggaggaaaggcggagcaatctgtcacttgtggatgggcctgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcgacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatgggcgaaagcctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgccagggaagaacgcctggtagagtaactgctcttgaagtgacggtacctgagaagaaagccccggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagcgcgcgcaggcggctctttaagtctggtgtttaatcccgaggctcaacttcgggtcgcactggaaactggggagcttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctgggctgtaactgacgctgaggcgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgaatgctaggtgttaggggtttcgatacccttggtgccgaagttaacacattaagcattccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacggggacccgcacaagcagtggagtatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatccctttgaccggtctagagatagacctttccttcgggacagaggagacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgcttagttgccagcaggtcaagctgggcactctaagcagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtactacaatggccggtacaacgggaagcgaaggagcgatgtggagccaatcctagaaaagccggtctcagttcggattgtaggctgcaactcgcctacatgaagtcggaattgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtg以筛选获得的多粘类芽孢杆菌dn-1与春雷霉素复配得到杀菌组合物，其中多粘类芽孢杆菌dn-1含量为（10～30）亿芽孢/g，春雷霉素的质量百分数为（1～10）%。所述的杀菌组合物，优选的多粘类芽孢杆菌含量为（10～30）亿芽孢/g，春雷霉素的质量百分数为（2～4）%。所述的杀菌组合物，其剂型加工为水悬浮剂、可湿性粉剂。采用的农用杀菌剂助剂包括表面活性剂、增稠剂、酸度调节剂、防冻剂、消泡剂、填料等各类助剂。采用的表面活性剂为十二烷基苯磺酸钙、木质素磺酸钙、木质双酸钠、2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐、蓖麻油与环氧乙烷缩合物、烷基酚聚氧乙烯基醚、烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯中的一种或多种的混合；采用的增稠剂为黄原胶、硅酸镁铝中的一种或两种混合；所述的酸度调节剂为醋酸；采用的防冻剂为乙二醇、丙三醇中的一种或两种的组合；采用的消泡剂为磷酸三丁酯、有机硅油消泡剂中的一种或两种的组合，采用的填料为高岭土、凹凸棒土、白炭黑、玉米淀粉中的一种或几种的组合。所述的杀菌组合物制备成水悬浮剂的方法是：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌dn-1活菌及发酵液，混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节ph值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。所述的杀菌组合物制备成可湿性粉剂的方法是将春雷霉素、固态表面活性剂与填料混合均匀，气流粉碎，得半成品a，将多粘类芽孢杆菌发酵液及活菌用半成品a进行吸附，混合均匀，冷冻干燥，即得成品。所述的杀菌组合物用于防治水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病等多种作物病害。具体实施方式:下面结合实施例对本发明作进一步说明，但本发明的实质并不限于下述实施例。实施例130亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-130亿芽孢/g；春雷霉素2%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌dn-1发酵液和水余量。制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌活菌及发酵液，混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节ph值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。实施例230亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•3%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-130亿芽孢/g；春雷霉素3%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌dn-1发酵液和水余量。制备方法，同实施例1。实施例330亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•4%春雷霉素水剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-130亿芽孢/g；春雷霉素4%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌dn-1发酵液和水余量。制备方法：同实施例1。实施例410亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-110亿芽孢/g；春雷霉素2%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌dn-1发酵液和水余量。制备方法，同实施例1。实施例520亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水悬浮剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-120亿芽孢/g；春雷霉素2%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌dn-1发酵液和水余量。制备方法，同实施例1。实施例620亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-130亿芽孢/g；春雷霉素2%；2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐2%木质素磺酸钙4%；白炭黑7%；高岭土余量/2；凹凸棒土余量/2。制备方法：所述的杀菌组合物制备成可湿性粉剂的方法是将春雷霉素、固态表面活性剂与填料混合均匀，气流粉碎，得半成品a，将多粘类芽孢杆菌发酵液及活菌用半成品a进行吸附，混合均匀，冷冻干燥，即得成品。实施例720亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•3%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-120亿芽孢/g；春雷霉素3%；2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐2%木质素磺酸钙4%；白炭黑7%；高岭土余量/2；凹凸棒土余量/2。制备方法，同实施例6。实施例820亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•4%春雷霉素可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-120亿芽孢/g；春雷霉素4%；2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐2%木质素磺酸钙4%；白炭黑7%；高岭土余量/2；凹凸棒土余量/2。制备方法，同实施例6。对照例110亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-110亿芽孢/g；2-萘磺酸甲醛聚合物钠盐2%木质素磺酸钙4%；白炭黑7%；高岭土余量/2；凹凸棒土余量/2。制备方法，同实施例5。对照例230亿芽孢/g多粘类芽孢杆菌•2%春雷霉素水剂（不添加发酵液）的制备方法：按质量百分比（多粘类芽孢杆菌dn-1除外）。多粘类芽孢杆菌dn-130亿芽孢/g；春雷霉素2%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；水余量。制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌活菌（不含发酵液），混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节ph值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。对照例3多粘类芽孢杆菌发酵液•2%春雷霉素水剂（不添加发酵液）的制备方法：按质量百分比。春雷霉素2%；木质素磺酸钠6%；烷基酚聚氧乙烯基磷酸酯4%；蓖麻油与环氧乙烷缩合物5%黄原胶0.1%；硅酸镁铝3%；磷酸三丁酯0.3%；多粘类芽孢杆菌发酵液30%；水余量。制备方法：将春雷霉素完全溶解于水中，加入表面活性剂搅拌均匀后引入多粘类芽孢杆菌发酵液（滤去芽孢及菌体），混合均匀后加入增稠剂、防冻剂，用酸度调节剂调节ph值为7.0-6.0，混合均匀后高速剪切，过滤残渣即得成品。在田间下测定制剂对水稻稻瘟病、棉花枯萎病、番茄灰霉病的防治效果：实验方案如下：各试验采用随机区组设计，小区面积40㎡，4次重复，随机排列，每个处理间设保护行。供试药剂、对照药剂及用药量：实施施例1至实施例8制剂用药量为60g/亩，对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌(wh1g)wp（市购）制剂用药量为200g/亩，4%春雷霉素水剂制剂用药量为60g/亩，另设喷清水的空白对照。水稻稻瘟病的防治于水稻孕穗期进行第一次叶面喷雾处理，7天后进行第二次施药；棉花枯萎病的防治于棉花枯萎病初发时进行第一次灌根处理，7天和14天后分别进行第二次和第三次施药，每次每亩喷施药液量为50升，均匀喷雾；番茄灰霉病的防治于番茄灰霉病初发时进行第一次叶面喷雾处理，7天和14天后分别进行第二次和第三次施药，每次每亩喷施药液量为50升，均匀喷雾。施药器械为ws-16型背负式手动喷雾器。在药剂处理前进行病害基数调查，末次施药7天后调查病害发生情况。调查方法、分级、药效计算均执行中华人民共和国国家标准，《农药田间药效试验准则》。试验结果：表1多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对水稻稻瘟病的田间防治效果项目制剂量（g/亩）防治效果（%）4%春雷霉素水剂6065.3510亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂20056.17实施例16075.16实施例26077.07实施例36076.53实施例46066.81实施例56071.43实施例66077.54实施例76072.19实施例86071.37对照例120060.24对照例26070.57对照例36059.64表2多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对棉花枯萎病的田间防治效果项目制剂量（g/亩）防治效果（%）4%春雷霉素水剂6059.7410亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂20060.33实施例16073.15实施例26074.09实施例36072.18实施例46061.27实施例56066.94实施例66071.54实施例76069.75实施例86070.55对照例120063.87对照例26068.53对照例36051.44表3多粘类芽孢杆菌•春雷霉素组合物末次施药后对番茄灰霉病的田间防治效果项目制剂量（g/亩）防治效果（%）4%春雷霉素水剂6067.6310亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂20063.24实施例16077.25实施例26075.33实施例36078.12实施例46069.27实施例56071.64实施例66075.06实施例76074.24实施例86075.66对照例120067.57对照例26072.36对照例36060.04水稻稻瘟病、棉花枯萎病和番茄灰霉病的田间防治试验结果如表1-表3所示。从表1和表3结果可以看出，8个实施例除实施例4外，对水稻稻瘟病和番茄灰霉病的防效均在70%以上，从表2可以看出，8个实施例除实施例4、实施例5和实施例7外，对棉花枯萎病的防效也均在70%以上；8个实施例除实施例4外，对水稻稻瘟病、棉花枯萎病及番茄灰霉病的防效均明显高于对照例1、对照例3及对照药剂4%春雷霉素水剂和10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的防效。从实施例1、实施例6与对照例2的防治效果比较可以看出，组合物中加入多粘芽孢杆菌dn-1发酵液能明显提升组合物的防治效果；从对照例1与对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂的防治效果可以看出，本发明组合物中的多粘芽孢杆菌dn-1对水稻稻瘟病、棉花枯萎病及番茄灰霉病均具有较高的生物活性，其防治效果高于对照药剂10亿芽孢/g亿多粘类芽孢杆菌可湿性粉剂。当前第1页12