本发明涉及一种杂交铁线莲的组织培养技术，尤其涉及一种杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法。
背景技术：
铁线莲属(clematisl.)植物是毛茛科(ranunculaceae)一类观赏价值高、具有多种抗逆性的藤本植物，其花色艳丽，为藤本中的佼佼者，有“藤本植物皇后”的美誉。目前，对铁线莲属植物的研究主要集中在种质资源调查、系统分类研究和栽培繁殖等方面。
铁线莲属植物存在结实少或萌发时间长、发芽率低等问题，园林栽培应用受到限制，组织培养方面的研究已逐渐展开。
现有技术中：
2002年，泽仁旺姆研究甘青铁线莲(c.tangutica)组织培养，解决了该植物种子萌发时间长、发芽率低等问题，提高了其繁殖率。2004年，李宗艳以转子莲(c.patens)叶或茎尖作外植体，探究不同培养基和不同植物生长调节剂对组培的影响，研究表明诱导愈伤组织的配方以ms+6-ba2.0mg/l+2,4-d1.0mg/l和ms+6-ba2.0mg/l+iba1.0mg/l较好；继代增殖培养以ms+6-ba2.0mg/l+naa0.5mg/l的配方较好；生根培养基配方以1/2ms+iaa0.8mg/l较好。2007年，张启香研究发现铁线莲‘multi-blue’茎尖在附加0.5mg/ltdz+0.01mg/lnaa+2％蔗糖的1/2ms培养基上培养一个月芽增殖率为200.8％。2008年，张涛以重瓣铁线莲(c.floridavar.plena)的茎段为外植体，发现愈伤组织最适宜的诱导培养基为ms+1.0mg/l6-ba+0.8mg/l2,4-d+0.2mg/l。诱导率为90％。2010年，王磊对铁线莲‘utopia’线无菌外植体建立进行研究，为‘utopia’无性系建立及基因转化奠定了基础。
‘巴黎女人’与‘吉赛尔’是园林中观赏价值较高的铁线莲品种，实验室前期采用传统杂交育种获得了一定数量的f1代种子。然而，铁线莲育种过程中普遍存在萌发时间长、发芽率低等问题，严重限制了铁线莲研究与应用。因此，本研究使用种子萌发后的幼苗作为外植体进行组织培养，获得了大量无菌苗，为进一步开展铁线莲育种研究提供基础材料。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
本发明的杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法，以杂交铁线莲无菌试管苗为外植体，进行组培快繁，具体包括步骤：
a、无菌材料获得；b、增殖培养；c、生根培养；d、炼苗移栽。
由上述本发明提供的技术方案可以看出，本发明实施例提供的杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法，利用组织培养技术，在保证f1代数量的基础上，还能保证其性状的稳定遗传，为进一步筛选、育种提供基础。
具体实施方式
下面将对本发明实施例作进一步地详细描述。本发明实施例中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。
本发明的杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法，其较佳的具体实施方式是：
以杂交铁线莲无菌试管苗为外植体，进行组培快繁，具体包括步骤：
a、无菌材料获得；
b、增殖培养；
c、生根培养；
d、炼苗移栽。
所述步骤a包括：
将杂交铁线莲的种子在室温下用无菌水浸泡24h，在超净工作台上先用75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1-2次，然后用2％的次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲洗3次，放于无菌滤纸晾干。
所述步骤b中，增殖培养基配方为：1/2dkw+tdz0.1mol/l+ga30.1mol/l+6-ba0.5mol/l。
所述步骤c中，生根培养基配方为：1/2dkw+6-ba0.2mol/l+ga30.1mol/l+iba1.0mol/l，生根率为86.33％。
所述步骤d中，移栽前将生根苗从培养瓶内移出并用清水洗净根上粘附的培养基，栽于事先准备好的草炭土∶珍珠岩＝2∶1的混合基质容器中，移栽后浇透水，再覆盖塑料薄膜10-20d保湿保温，适当遮荫。
所述杂交铁线莲组织培养的条件为：
温度24℃，光照强度1600-2000lx，光照时间为14h/d，培养基上添加蔗糖30g/l，琼脂5g/l，调节ph5.8-6.0；
该培养条件适用于步骤a、b、c。
本发明的杂交铁线莲的组织培养快速繁殖方法，其母本为‘巴黎女人’(c.parisienne'evipo019')，父本为‘吉赛尔’(c.giselle'evipo051')。母本‘巴黎女人’为早花大花品种组，株高1.5-2.0m，花期6-7月，花为紫色；父本‘吉赛尔’，株高1.0-1.5m，花期5-10月，花为暗粉红色。
本发明利用组织培养技术，在保证f1代数量的基础上，还能保证其性状的稳定遗传，为进一步筛选、育种提供基础。
具体实施例：
1材料
一种杂交铁线莲(clematisparisienne'evipo019'×giselle'evipo051')的饱满种子。
2方法
(1)培养条件
杂交铁线莲组织培养的条件为温度24℃，光照强度1600-2000lx，光照时间为14h/d，培养基上添加蔗糖30g/l，琼脂5g/l，调节ph5.8-6.0。
(2)无菌材料获得
将杂交铁线莲的种子在室温下用无菌水浸泡24h，在超净工作台上先用75％的酒精浸泡30s，无菌水冲洗1-2次；然后用2％的次氯酸钠浸泡10min，无菌水冲洗3次，放于无菌滤纸晾干，将种子接种到1/2dkw基本培养基上进行培养，获取无菌试管苗。
(3)增殖培养
将无菌试管苗带叶茎段(2cm)进行增殖培养，基本培养基为1/2dkw，在添加0.1mol/ltdz，0.1mol/lga3的基础上，加入不同浓度梯度的6-ba(0、0.2、0.5、1.0、2.0mg/l)进行处理，具体见表1，进行丛生芽的诱导。每个处理接种20个，3次重复，30d后统计增殖情况。
增殖倍数＝培养30d后诱导出的丛生芽个数/接种芽数
表1tdz,ga3与不同浓度6-ba处理组合
(4)生根培养
选取高2cm左右健壮的增殖芽进行生根培养。以1/2dkw为基本培养基，添加一定浓度的6-ba(0.2mg/l)、ga3(0.1mol/l)和不同质量浓度iba(0、0.5、1.0、2.0mg/l)，具体见表2，每个处理接种20个，3次重复，30d后统计生根率，并记录生长状况。
生根率＝(生根苗数/接种苗数)×100％
表26-ba,ga3与不同浓度iba处理组合
(5)炼苗移栽
把生根良好的杂交铁线莲试管苗进行炼苗移栽。移栽前将生根瓶苗移至温室炼苗7d左右，移栽前2d旋松瓶盖。移栽前将生根苗从培养瓶内移出并用清水洗净根上粘附的培养基，栽于事先准备好的草炭土∶珍珠岩＝2∶1的混合基质容器中，移栽后浇透水，再覆盖塑料薄膜10-20d保湿保温，适当遮荫，以提高成活率。30d后统计移栽成活率。
移栽成活率＝(移栽成活数/移栽植株总数)×100％
(6)数据处理
利用excel软件、spss19.0软件对试验数据进行处理。
3本发明技术方案带来的有益效果：
(1).不同浓度6-ba对无菌试管苗增殖的影响
将无菌试管苗带叶茎段转接到含不同浓度6-ba的培养基中进行增殖培养。试验结果表明，当6-ba浓度为0.5mol/l时，平均增殖倍数最高，为5.9倍，此时得到的丛生芽最多且生长良好；当6-ba浓度为0时，无菌试管苗也能增殖，但是增殖的数量较少，丛生芽长势较弱；不同处理间，平均增殖倍数存在显著性差异(表3)；表明6-ba对杂交铁线莲的增殖具有重要的促进作用。随着6-ba浓度的增加，平均增殖倍数先升高后降低，表明高浓度的6-ba对杂交铁线莲的增殖具有抑制作用。因此，本发明中适宜杂交铁线莲增殖的培养基配方为1/2dkw+tdz0.1mol/l+ga30.1mol/l+6-ba0.5mol/l。
表3不同浓度6-ba对无菌试管苗增殖的影响
注:表中小写字母表示处理间在p<0.05水平上差异显著
(2).不同浓度的iba对丛生芽生根的影响
将增殖培养得到的健壮丛生芽转接到生根培养基上进行生根诱导。试验结果表明，当iba的浓度为1.0mol/l时生根率最高，可达86.33％，此时诱导出的根较粗壮，组培苗长势良好，叶色浓绿；当iba的浓度为0时，组培苗叶生根，但是生根率最低，生根条数也较少；不同处理间，生根率存在显著性差异(表4)；表明iba对诱导杂交铁线莲的生根具有重要的促进作用。随着iba浓度的增加，生根率先升高后降低，表明高浓度的6-ba对杂交铁线莲的生根具有抑制作用。因此，本发明中适宜杂交铁线莲生根的培养基配方为1/2dkw+6-ba0.2mol/l+ga30.1mol/l+iba1.0mol/l。
表4不同浓度6-ba对丛生芽生根的影响
注:表中小写字母表示处理间在p<0.05水平上差异显著
4.试管苗炼苗移栽
将生根的试管苗移栽至草炭土∶珍珠岩＝2∶1的基质中，置于温室进行培养，30d后成活率为86.81％。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书的保护范围为准。