一种莲子心提取液的制备方法及其应用与流程

本发明涉及生物领域，尤其涉及一种莲子心提取液的制备方法及其应用。
背景技术：
：水稻白叶枯病是由水稻黄单胞杆菌(xanthomonasoryzaepv.oryzae)引起的,是中国水稻主要病害之一。水稻白叶枯病的病原致病菌包含白叶枯病菌和条斑病菌两种，白叶枯病菌为革兰氏阴性菌，无芽孢和荚膜，菌体外具有粘质的孢外多糖包围。目前白叶枯病菌的防治多以化学药剂为主，但发病严重时药效较差且带来一定污染。在我国各水稻产区时有发生，受害水稻叶片枯萎、产量减少，对水稻的稳产造成严重威胁。目前防治水稻白叶枯病菌的主要途径是化学防治，通过使用链霉素、氯霉素、叶枯唑、噻枯唑等化学制剂来防治水稻白叶枯病菌。虽在水稻白叶枯病菌发病初期起到一定的防治作用，但发病严重时防治效果差，而且也产生了极大的负面影响。过度使用化学农药容易产生污染环境，破坏土壤理化性质，破坏生态平衡，导致病原菌抗性增强以及化学农药残留对人体不安全等一系列问题。生物防治具有对环境安全无污染，是防治水稻白叶枯病菌的有效途径。研究表明，植物中含有大量的抑菌活性物质，且具有广谱抑菌特性。武陵山区地域广阔、气候条件独特、植物资源丰富，是华中地区的资源宝库。技术实现要素：本发明的目的在于提供了一种可抑制水稻白叶枯病菌的莲子心提取液及其制备方法。本发明提供的技术方案为一种莲子心提取液，其制备方法如下：步骤1：将莲子心烘干后，研磨成粉末；步骤2：将步骤1中的粉末用乙醇进行第一次溶解，进行超声、离心，取上清液；步骤3：将步骤2得到的上清液减压烘干，用蒸馏水溶解；步骤4：将步骤3所得溶液用氯仿进行萃取，再次减压烘干，然后加入乙醇进行第二次溶解制得莲子心提取液。而且，步骤2中用乙醇进行第一次溶解是将粉末状莲子心与90％浓度的乙醇以料液比1：15溶解。而且，步骤4中所述加入乙醇是加入90％浓度的乙醇。以及，所述的莲子心提取液对水稻白叶枯病菌的抑制作用。以及，所述的莲子心提取液对水稻防卫基因表达的诱导作用。而且，所述水稻防卫基因为wrky45基因、pr1b基因和pz1基因。与现有技术相比，该技术方案的有益效果在于：提供了一种可抑制水稻白叶枯病菌的莲子心提取液及其制备方法，该莲子心提取液能有效抑制水稻白叶枯病菌，诱导水稻防卫基因表达。而且该提取液是对人畜安全、无污染、低毒、低残留的植物源杀菌剂。附图说明图1为植物提取液抑菌圈平均直径柱形图；图2为莲子心(正丁醇)抑菌效果图；图3为莲子心(石油醚)抑菌效果图；图4为莲子心(氯仿)抑菌效果图；图5为莲子心(石油醚)的活体防治结果；图6为相关防卫基因的表达量检测。具体实施方式本发明的莲子心提取液的制备方法如下：水稻白叶枯病菌(xanthomonascampestrispv.oryzae(ishiyama)dye：由中南民族大学生命科学学院提供。供试植物提取液：红花(水部)，红花(正丁醇)，北豆根(水部)，蒲公英(乙酸乙酯)，黄柏(乙酸乙酯)，莲子心(正丁醇)，莲子心(石油醚)，莲子心(氯仿)，苦瓜(正丁醇)，苦瓜(石油醚)，苦瓜(氯仿)，獐牙菜(正丁醇)，獐牙菜(乙酸乙酯)。供试试剂：氨苄青霉素钠(2mg/ml)，75％乙醇，胁本哲氏培养基pda(土豆300g/l煮成泥状，6层纱布过滤；蔗糖15g/l；蛋白胨5g/l；ca(no3)2·4h2o0.72g/l；nah2po4·2h2o2.6g/l；，琼脂粉20g/l；无菌水)。trizol；axyrep总rna小量制备试剂盒；实时荧光定量试剂盒sybrpremixextaq、反转录试剂盒primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser。一、植物提取液的制备：苦瓜(正丁醇)：将苦瓜粉称重用90％乙醇以料液比1：20溶解；在超声震荡仪内56度超声波1h，4度4000rpm离心20分钟取上清于圆底烧瓶内，在旋转减压烘干仪内56度减压烘干，再用蒸馏水充分溶解，然后用适量正丁醇萃取2～3次，转入新的圆底烧瓶内以70度再次减压烘干，然后用75％乙醇溶解成一定浓度的苦瓜(正丁醇)溶液[7·9]。莲子心(氯仿)：将莲子心烘干后，称取5g在研钵内用液氮研磨成粉末状，用90％乙醇以料液比1：15溶解，在超声波震荡仪内60度超声1h，4度4000rpm离心20分钟，转移上清于新的圆底烧瓶内，在旋转减压烘干仪内60度减压烘干，烘干后用蒸馏水多次溶解，再用适量氯仿萃取2～3次后转入新的圆底烧瓶内以60度再次减压烘干，然后用5ml75％乙醇溶解制的1g/ml的莲子心(氯仿)溶液。二、菌种活化在超净工作台内，吸取10ul原白叶枯病菌菌种在胁本哲氏培养基内划线，28度培养3天，再挑取白叶枯病菌单菌落于胁本哲氏液体培养基内150rpm，28度培养48h。三、不同植物提取液对白叶枯病菌的最低抑制浓度(mic)将植物提取液过滤除菌后，用无菌水稀释为不同的浓度梯度，吸取lml植物提取液加入9ml热溶的pda培养基中，混匀，倒入直径为9cm的玻璃培养皿中，配制成带药培养基，以75％乙醇做为对照组。每个处理设3个重复。待培养基冷却凝固后，吸取0.1ml供试菌液(od值0.6)加到带药培养基表面，涂布均匀。28℃恒温培养箱中培养48h，观察各培养皿中病原菌的生长情况，并记录结果。完全不长菌的最低药液浓度即为最低抑制浓度。其结果分析如下：由表1可以看出莲子心(石油醚)及苦瓜(乙酸乙酯)的mic值很小，可知其抑菌效果较好。表1植物提取液mic值供药试剂100mg/mlmic(mg/ml)莲子心(石油醚)1～3苦瓜(乙酸乙酯)4～5苦瓜(正丁醇)>5七叶一枝花>5北豆根(水部)>5红花(水部)>5黄柏(水部)>5红花(正丁醇)>5獐牙菜(正丁醇)>5四、植物提取液的抑菌活性琼脂片法吸取od值约为0.6的白叶枯菌悬液0.2ml，均匀涂布于pda平板上，用灭菌后的镊子取出灭过菌的滤纸片均匀贴在平板上，在平板后对应标注药剂名称，然后依次吸取5ul氨苄青霉素钠(2mg/ml)垂直滴在滤纸片上做阳性对照，10ul75％乙醇于垂直滤纸片上做阴性对照，吸取不同浓度梯度的植物提取液于滤纸片上做实验组，用封口膜密封于28℃培养箱中倒置培养48h后，用直尺量出抑菌圈的直径，以抑菌圈直径作为衡量不同植物提取液萃取相的抑菌活性指标。其结果分析如下：表2为植物提取液抑菌圈直径mm供试药剂抑菌圈直径mm氨苄青霉素钠(2mg/ml)10.7075％乙醇9.30莲子心(石油醚)13.83莲子心(正丁醇)13.00莲子心(氯仿)11.75苦瓜(正丁醇)9.66苦瓜(氯仿)11.25红花(水部)7.83红花(正丁醇)7.33獐牙菜(正丁醇)9.16獐牙菜(乙酸乙酯)11.00蒲公英(乙酸乙酯)9.00黄柏(乙酸乙酯)7.00北豆根(水部)7.83抑菌圈直径图示结果及分析如下：图1为植物提取液抑菌圈平均直径柱形图；由图1可以看出莲子心(石油醚)及莲子心(正丁醇)抑菌圈直径较大，即在这13种植物提取液中对白叶枯病菌的抑制效果最好；其次依次是莲子心(氯仿)，苦瓜(氯仿)，獐牙菜(乙酸乙酯)。图2为莲子心(正丁醇)抑菌效果图；其中包含：2-1:阳性对照：2mmamp5ul；2-2:阴性对照：75％乙醇10ul；2-3:实验组：20mg/ml莲子(正丁醇)10ul；2-4:实验组：100mg/ml莲子心(正丁醇)10ul。图3为莲子心(石油醚)抑菌效果图；其中包含：3-1：阳性对照:2mmamp5ul；3-2:阴性对照：75％乙醇10ul；3-3:实验组：1g/ml莲子心(石油醚)10ul；3-4：实验组：0.5g/ml莲子心(石油醚)10ul。图4为莲子心(氯仿)抑菌效果图，其中包含：4-1:阳性对照：2mmamp5ul；4-2:阴性对照：75％乙醇10ul；4-3:实验组：20mg/ml莲子心(氯仿)10ul；4-4:实验组：100mg/ml莲子心(氯仿)10ul。五、植物提取液对白叶枯病菌的活体防治方法对水稻品种日本晴种子发苗并分4盆进行移栽，设置2个对照组和2个实验组，对照组1不做处理，对照组2只接种，实验组1先接种后喷药，实验组2先喷药后接种。待水稻长至12叶期时，准备莲子心(石油醚)提取液200ml，第一天对实验组2的水稻喷施莲子心(石油醚)提取液100ml，第二天吸取od值约为0.6的白叶枯菌悬液100ml，对对照组2、实验组1和实验组2接种白叶枯病菌，第三天对实验组1的水稻喷施莲子心(石油醚)提取液100ml。两周后进行统计，测量叶片病斑的长度和面积。其结果分析如下：图5为莲子心(石油醚)的活体防治结果，接种后喷药的叶片感染白叶枯的平均病斑长度明显降低，说明莲子心(石油醚)对白叶枯病菌在离体和活体水平上均具有很好的抑制活性，具有潜在的研究和应用价值。六、防卫基因的表达检测方法测量叶片病斑的长度和面积后，对照组与实验组分别取叶片，提取rna，反转cdna后进行表达量分析，分别检测防卫基因wrky45、pz1、pr1b的表达量。其结果分析如下：用莲子心(石油醚)提取液对接种白叶枯病菌的水稻进行活体防治实验实验中，分别提取实验组与对照组的水稻叶片的rna,反转录cdna进行表达量分析。结果表明对接种白叶枯病菌的水稻喷施莲子心(石油醚)提取液14d后，wrky45基因表达量上调1.8倍，pr1b基因表达量上调2.25倍，pz1基因表达量上调3.67倍。图6为相关防卫基因的表达量检测，图6中从左至右依次为wrky45、pz1、pr1b的表达量检测情况。综上所述，离体抑菌实验和活体防治实验均表明莲子心提取液对白叶枯病菌具有较强的抑菌活性，对接种白叶枯病菌的水稻喷施莲子心提取液后，wrky45基因、pr1b基因、pz1基因表达量均有不同程度的上调，莲子心的有效抑菌成分可能诱导或引起植物体内防卫基因的表达，增加水稻的基础抗性。当前第1页1 2 3