厚壳贻贝的贝壳粉在海洋细菌的抑菌性方面中的应用的制作方法

本发明属于抗菌材料技术领域，具体涉及一种厚壳贻贝的贝壳粉在海洋细菌的抑菌性方面中的应用。

背景技术：

抑菌是抑制待处理体系中微生物的活性，使之繁殖能力降低或抵制繁殖的过程。在海洋环境中，某些海洋细菌是海洋生物的致病菌；一些细菌会参与对各种海洋物质的腐蚀、变性、污秽和破坏过程；在特定条件下，海洋细菌代谢产物的积累会毒化养殖环境，如氨和硫化氢对生物养殖的危害。随着对海洋细菌的环境破坏性越来越受重视，性能无毒、高效和安全的生物抗菌材料被许多研究者注意。

贝壳是软体动物外套膜，为一种典型的天然生物矿化材料，有十分特殊的内部显微结构，具有耐久性、化学稳定性和耐热性等特点。其中角质层具有薄而透明、抗酸腐蚀等特点。贝壳来源广泛，开发潜力大，但在抑菌研究中所涉及的贝壳种类却很少。

厚壳贻贝(mytiluscoruscus)，隶属于软体动物门(mollusca)，双壳纲(bivalvia)，贻贝目(mytilodia)，贻贝科(mytilidae)，是我国重要的海产贝类养殖品种，分布于黄海、渤海和东海沿岸。厚壳贻贝营养价值较高，具有开阔的养殖前景和市场开发潜力。随着我国厚壳贻贝养殖产量不断扩大，废弃贝壳加剧了环境压力。

技术实现要素：

针对现有技术中的不足，本发明的目的是提供一种厚壳贻贝的贝壳粉在海洋细菌的抑菌性方面中的应用。

为达到上述目的，本发明的解决方案是：

一种厚壳贻贝的贝壳粉在海洋细菌的抑菌性方面中的应用。

在本发明的一种具体实施例中，将废弃的厚壳贻贝的贝壳经过清洗、烘干、研磨和煅烧，得到厚壳贻贝的贝壳粉；将待测海洋细菌接种液体培养基内进行活化，然后将厚壳贻贝的贝壳粉加入液体培养基内进行反应，并在121±10℃灭菌待用。

在本发明的一种具体实施例中，研磨后，贝壳粉的直径≤100μm。

在本发明的一种具体实施例中，煅烧的温度为500±10℃，煅烧的时间为1.5±0.5h。

在本发明的一种具体实施例中，待测海洋细菌选自希瓦氏菌、灿烂弧菌和假交替单胞菌。

在本发明的一种具体实施例中，液体培养基为lb液体培养基。

在本发明的一种具体实施例中，lb液体培养基的配制组分为：胰蛋白胨、酵母膏和琼脂。

在本发明的一种具体实施例中，活化的温度为25±2℃，活化的时间为12±1h。

在本发明的一种具体实施例中，反应的温度为25±2℃，反应的时间为2±0.5h。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明的煅烧后厚壳贻贝的贝壳粉在不同浓度时对希瓦氏菌、灿烂弧菌和假交替单胞菌的抑菌效果不同，24h抑菌率分别达到93.6％、92.1％和95.7％。在希瓦氏细菌及灿烂弧菌生长中，煅烧贝壳粉对希瓦氏细菌及灿烂弧菌的抑菌效果分别在3h和6h已趋于稳定，随着时间增加，贝壳粉的抑菌率无显著差异。因此，厚壳贻贝的贝壳粉对一定的海洋细菌有抑菌性，抑菌效果可以在较短的时间内趋于稳定，为废弃厚壳贻贝的贝壳的资源化利用提供了新方向。

附图说明

图1为本发明的不同浓度的厚壳贻贝的贝壳粉对希瓦氏菌的抑菌率效果示意图。

图2为本发明的不同浓度的厚壳贻贝的贝壳粉对灿烂弧菌的抑菌率效果示意图。

图3为本发明的不同浓度的厚壳贻贝的贝壳粉对假交替单胞菌的抑菌率效果示意图。

图4为本发明的厚壳贻贝的贝壳粉对希瓦氏菌和灿烂弧菌的抑菌率效果示意图(左：希瓦氏菌右：灿烂弧菌，a、b、c是差异性分析)。

具体实施方式

本发明提供了一种厚壳贻贝的贝壳粉在海洋细菌的抑菌性方面中的应用。

其中，收集废弃的厚壳贻贝的贝壳，经过清洗、烘干处理后，利用球磨仪将贝壳研磨成均匀大小，使得贝壳粉的直径≤100μm，然后在马弗炉内煅烧，得到厚壳贻贝的贝壳粉，取出并密封保存待用。将希瓦氏菌(shewanellaloihica)、灿烂弧菌(vibriosplendidus)和假交替单胞菌(pseudoalteromonasatlantica)接种于lb液体培养基内进行活化，25℃摇床培养12h备用。然后将煅烧后厚壳贻贝的贝壳粉加入lb液体培养基内进行反应，将此液体培养基放置磁力搅拌器上，在1000rpm，25℃下运行2h，测量该液体培养基的ph值为7.5，并在121±10℃灭菌待用。

其中，煅烧的温度为500±10℃，煅烧的时间为1.5±0.5h。

lb液体培养基采用生工生物工程上海股份有限公司的合成培养基，其配制的组分为：胰蛋白胨、酵母膏和琼脂。

厚壳贻贝的贝壳粉的浓度为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml和10mg/ml。

根据v菌液：v培养基＝1：100的比例在lb液体培养基中加入菌液，其中，菌液是培养好的shewanellaloihica菌液、vibriosplendidus菌液和pseudoalteromonasatlantica菌液的单一菌液；配置过程为将shewanellaloihica、vibriosplendidus和pseudoalteromonasatlantica分别接种于lb液体培养基中活化，25℃摇床培养12h。对照组1为纯lb液体培养基，对照组2为添加不同浓度的贝壳粉lb液体培养基，实验组1为接种实验菌的纯lb液体培养基，实验组2为加入不同浓度的贝壳粉和实验菌的lb液体培养基。对照组和实验组在25℃，200rpm培养箱中培养24h，在600nm处测菌液的od值。按如下公式计算抑菌率：

at＝1-(od2-odc2)/(od1-odc1)×100％

式中at为比浊法测得抑菌率，odc1为对照组1吸光度，od1实验组1的吸光度，odc2为对照组2的吸光度，od2为实验组2的吸光度。

以下结合实施例对本发明作进一步的说明。

实施例1：

本实施例将shewanellaloihica、vibriosplendidus和pseudoalteromonasatlantica接种于lb液体培养基中进行活化，25℃摇床培养12h备用。将煅烧后的厚壳贻贝的贝壳粉加入lb液体培养基中，贝壳粉的添加浓度分别为1mg/ml、2mg/ml、4mg/ml、6mg/ml、8mg/ml和10mg/ml；将此培养基放置磁力搅拌器上，在1000rpm，25℃下运行2h；测量该液体培养基的ph值并在121℃高温灭菌待用。

根据v菌液：v培养基＝1：100的比例在该液体培养基中加入菌液。对照组1为纯lb液体培养基，对照组2为添加不同浓度的贝壳粉的lb液体培养基，实验组1为接种实验菌的纯lb液体培养基，实验组2为加入不同浓度的贝壳粉和实验菌的lb液体培养基。对照组和实验组在25℃，200rpm摇床中培养24h后，取3ml菌液在600nm处测菌液的od值。并按照上述公式(即通过浊度比色法比较不同添加浓度的贝壳粉对不同菌种的抑菌率)计算各浓度的抑菌率。

贝壳粉抑制3株海洋细菌的抑菌率随浓度增加而增高。具体地，由图1可知，对希瓦氏菌，在贝壳粉添加浓度达到10mg/ml后抑菌率达到最大值为93.6％；由图2和图3可知，对于灿烂弧菌和假交替单胞菌，在贝壳粉添加浓度为8mg/ml时抑菌率达到最大，分别为92.1％和95.7％，且浓度增加到10mg/ml时其抑菌活性基本不再随着浓度的增加而加强。综合来看，煅烧后的厚壳贻贝的贝壳粉对于此次实验所采用的3株海洋细菌均有明显抑菌作用，在贝壳粉浓度达到10mg/ml时有非常明显的抑菌效果。

实施例2：

本实施例的厚壳贻贝煅烧贝壳粉在抑菌性时间变化实验如下。将shewanellaloihica和vibriosplendidus接种于lb液体培养基中进行活化，25℃摇床培养12h备用。将煅烧后的厚壳贻贝的贝壳粉加入lb液体培养基中，贝壳粉的添加浓度为10mg/ml；将此培养基放置磁力搅拌器上，在1000rpm，25℃下运行2h；测量该液体培养基的ph值并在121℃高温灭菌待用。

根据v菌液：v培养基＝1：100的比例在该液体培养基中加入菌液。对照组1为纯lb液体培养基，对照组2为贝壳粉浓度为10mg/ml的lb液体培养基，实验组1为接种实验菌的纯lb液体培养基，实验组2为加入贝壳粉浓度为10mg/ml和实验菌的lb液体培养基。对照组和实验组在25℃，200rpm摇床中培养，分别在培养1h、3h、6h、12h、18h和24h后，取3ml菌液在600nm处测菌液的od值。并按照上述公式计算各时间的抑菌率。

如图4所示，在固定添加浓度贝壳粉的培养基中，贝壳粉可以在短时间内达到抑菌效果。对于希瓦氏菌(a)，在贝壳粉作用细菌3h时就能够有较稳定的抑菌效果；对灿烂弧菌(b)，此抑菌效果在6h趋于稳定，随后浓度增加贝壳粉的抑菌率变化不大。因此，贝壳粉可以保证一定时间内的稳定抑菌效果，此种抑菌特点对于贝壳粉实际应用很重要。

综上可知，希瓦氏菌、灿烂弧菌和假交替单胞菌三种海洋细菌，在培养基中煅烧贝壳粉浓度为10mg/ml、8mg/ml和8mg/ml条件下可达到较好的抑菌效果，其24h抑菌率分别可达到93.6％、92.1％和95.7％。在希瓦氏细菌及灿烂弧菌生长中，煅烧贝壳粉对希瓦氏细菌及灿烂弧菌的抑菌效果分别在3h和6h已趋于稳定，随着时间增加，贝壳粉的抑菌率无显著差异。故厚壳贻贝的贝壳粉对一定的海洋细菌有抑菌性，抑菌效果可以在较短的时间内趋于稳定。即在添加固定浓度贝壳粉的培养基中，贝壳粉可以在短时间内达到抑菌效果，因此贝壳粉可以保证一定时间内的稳定抑菌效果，此种抑菌特点对于贝壳粉实际应用来说很重要。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。