冷冻干燥生物样品的装置和方法与流程

发明背景

本申请要求2018年1月22日提交临时申请序列号62/619,934和2018年2月25日提交的临时申请序列号62/634,868的优选权。将这些申请中的每个的全部内容通过引入并入本文。

本申请涉及冷冻干燥比如精子、卵母细胞、胚胎、生殖组织和干细胞等生物样品的方法以及进行这种冷冻干燥的装置。

背景技术：

冷冻保存对于两性配子以及许多家养和野生物种的胚胎都非常有效。各种物种都有其独特的方面、敏感性和限制性，但种质可以冷冻保存、存储并最终用于辅助生殖程序。然而，这种有效的冷冻保存方法价格昂贵。将冷冻保存的样品存储在液氮(ln)下具有很高的维护成本并且需要专门的专用设施和训练有素的工作人员。另外，运输麻烦且非常昂贵，并且需要有保证的且连续的ln供应。另一个缺点是，由于“脏的”ln或由于被污染的样品在样品之间存在病原体传播的风险。在液氮中存储生物样品的另一个缺点是储罐故障和样品的不可逆损失的风险。除了这些内在问题之外，ln的工业生产和分销以及专门的存储设施的能源需求具有严重的环境影响，留下大量的碳足迹。

提供液氮冷冻保存的替代方案将是有利的。这种替代方案通过降低成本、简化工艺、降低污染的风险并且使对环境的影响最小化而克服上述限制性和缺点。

技术实现要素：

本发明通过提供冷冻干燥精子细胞、卵母细胞、胚胎以及比如卵巢、子宫和睾丸等的生殖组织的干燥过程克服了对于包括精子细胞、卵母细胞、胚胎和生殖组织的生物样品的液氮冷冻保存的缺点和不足。使用本文公开的设备，将生物样品浸入在特殊的冷冻干燥溶液/多种该溶液中，并且然后冷冻并干燥。通过随后再水化的结果使得可以用于辅助生殖技术，比如体外受精(ivf)、卵母细胞胞质内单精子注射(icsi)、包括植入前基因筛查(pgs)的基因筛查、包括植入前基因诊断(pgd)的基因诊断测试等。

本发明的液氮冷冻保存替代方案也可以用于干细胞保存。

本发明既提供了冷冻干燥保存的工艺，又提供了进行这种工艺的装置，以下将对其二者进行详细描述。该工艺涉及低温脱水工艺，其涉及快速冷冻生物样品，降低压力并通过升华去除冰。这以小体积进行，其有利地加快了该工艺。

根据本发明的一个方面，提供了用于冷冻干燥比如哺乳动物细胞或组织的生物样品的方法，该方法包括将生物样品的液滴、小体积或切片中的一种或多种放置在具有腔室的装置中，并且随着生物样品在密闭腔室中，施加真空至腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室的温度并且施加热至腔室内的生物样品。

在一些实施方式中，为了增加样品的温度，当预冷却的表面在腔室内时，将生物样品放置在该预冷却的金属表面；在其他实施方式中，将生物样品放置在腔室外部的所述预冷却的金属表面上或小瓶中，并且随后将所述预冷却的表面放置在腔室内。

在本文方法的一些实施方式中，生物样品包括来自人源或动物源的精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织或睾丸组织干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞或诱导的多功能干细胞的一种或多种。

在一些实施方式中，将生物样品在lyo溶液中稀释。在一些实施方式中，lyo溶液由a)dmso和碳水化合物或b)dmso和蛋白质组成。在一些实施方式中，lyo溶液是蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖葡聚糖和海藻糖中的一种或多种与比如dmso、eg、pg、甘油等的冷冻保护剂和比如has、fcs等的大分子以及比如虾青素、egcg、抗坏血酸等的抗氧化剂的组合。在一些实施方式中，lyo溶液可以与缓冲液或培养基溶液一起，后者包括tcm-199、tris、pbs或hepestalp、rpmi-1640、达尔伯克氏改良伊格尔培养基中的一种或多种。在一些实施方式中，lyo溶液由tris培养基、蛋黄、海藻糖和山梨糖醇组成。在一些实施方式中，lyo溶液含有10％的dmso和10％的hsa。

在一些实施方式中，方法包括将样品暴露在逐渐降低浓度的lyo溶液中知道达到最终浓度。

在一些实施方式中，冷却腔室的步骤包括将腔室的至少一部分插入在液氮或其他低温流体的容器中的步骤。在一些实施方式中，当腔室被放置在液氮的容器中时，腔室中的冷凝器和/或生物样品可以保持在液氮的液位以上。在一些实施方式中，腔室中的温度通过腔室/冷凝器相对于液氮液位的高度(level)来调节。

在一些实施方式中，将生物样品以缓慢的速率冷却至-3℃和-10℃之间的接种温度，并且进一步冷却至-7℃和-50℃之间的零下温度。

在一些实施方式中，腔室由聚碳酸酯、聚丙烯或特氟龙的塑料材料组成。

在一些实施方式中，lyo溶液是冻干保护的添加剂的百分比和细胞浓度之间的比率。在一些实施方式中，冻干保护性添加剂是dmso或海藻糖。

根据本发明的另一个方面，提供了冷冻干燥和再水化生物样品的方法，其包括a)将含有至少一种生物样品的载体插入到第一lyo溶液中；b)将载体从第一lyo溶液去除并将载体放置在第二lyo溶液中，第二lyo溶液不同于第一lyo溶液；c)将载体放置在装置的腔室中，该腔室具有用于存放所述至少一种生物样品的容器和用于降低腔室内温度的冷凝器；d)通过施加真空至腔室以降低腔室内的压力、降低腔室内的温度并加热至少一种生物样品来冷冻干燥至少一种生物样品；和e)在步骤(c)之后，将载体从装置去除并将载体插入到第三溶液，并且随后将载体从第三溶液去除并将载体插入到第四溶液以将至少一种生物样品再水化。

在一些实施方式中，将样品在22℃、30℃或37℃的温度下在再水化溶液中进行再水化，该再水化溶液在培养基中含有包括用于再水化干细胞的山梨糖醇、蔗糖和/或海藻糖中的一种或多种的糖。

在一些实施方式中，将干燥的细胞暴露于比如uv等的辐射。

在优选的实施方式中，腔室具有小于或等于两升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1.5升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1升的容积。

在优选的实施方式中，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于10cm，并且在更优选的实施方式中，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于2cm。

根据另一个方面，提供了用于在37℃的温度下在再水化溶液中再水化样品的方法，该再水化溶液含有糖，比如用于再水化精子的在蛋黄溶液和tris培养基中的山梨糖醇、蔗糖和海藻糖和用于再水化卵母细胞、胚胎或卵巢组织的1m海藻糖或蔗糖。

根据另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的方法，其包括将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，该密闭腔室被限定为其中压力将被降低的装置内的区域并且腔室具有小于或等于1.5升的容积。方法进一步包括施加真空至腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室内的温度，以及施加热至腔室中的生物样品。

在一些实施方式中，该容积小于或等于1升。

根据本发明的另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的方法，该方法包括将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，该密闭腔室被限定为其中压力将被降低的装置内的区域，并且腔室具有在其中限定的容积。装置具有在腔室内的冷凝器，其中生物样品被放置在腔室内使得冷凝器与样品之间的距离等于或小于10cm。方法包括施加真空至腔室以降低腔室内的压力，冷却腔室以降低腔室内的温度，以及施加热至腔室内的生物样品。

在一些实施方式中，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于2cm。

根据本发明的另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的方法，其包括a)将生物样品放置在具有密闭腔室的装置中，该密闭腔室被限定为其中压力将被降低的装置内的区域；b)将装置放置在低温流体的容器以冷却腔室；c)施加真空至腔室以降低腔室内的压力；以及d)施加热至腔室中的生物样品。

在上述中，腔室是打开的，并且然后在放置样品之后被关闭/密封。

在一些实施方式中，将装置放置在低温流体的容器以冷却腔室的步骤将冷凝器定位在腔室内，从而冷凝器与低温流体间隔开，从而使冷凝器保持在流体外部。低温流体可以是液氮。

优选地，从生物样品至冷凝器的距离等于或小于10cm，并且更优选地从生物样品至冷凝器的距离等于或小于2cm。

优选地，腔室具有小于或等于两升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1.5升的容积，并且在更优选的实施方式中，具有小于或等于1升的容积。

根据本发明的另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的装置，其包括a)具有第一内部空间的第一容器，该第一容器配置用于存储暴露于第一内部空间的内部环境的生物样品，其中第一容器配置为促进来自生物样品的冰晶升华；b)冷凝器，其配置为经受冷却环境以促进水蒸气相转变成固体，该冷凝器具有可以与第一内部空间联接并连通的第二内部空间，第一和第二内部空间形成密闭腔室，使得生物样品和冷凝器在同一腔室中，该腔室可联接至真空泵；c)其中第一容器和冷凝器配置为防止密闭的内部空间和外部环境之间交换颗粒。

在一些实施方式中，装置进一步包括用于供应能量至冷凝器以冷却冷凝器和第一和第二内部空间的冷却元件；在其他实施方式中，装置可定位在低温流体的容器中以冷却冷凝器。在一些实施方式中，低温流体在容器中处于第一高度并且冷凝器可定位在与低温流体间隔开的容器中，因此冷凝器保持在流体外部。

在一些实施方式中，低温流体(例如，液氮)容器可以包括将冷凝器支撑在低温流体液位上方的位置的提升元件，并且该提升元件可以被调节以调节冷凝器在低温流体液上方的距离。

根据本发明的另一个方面，提供了用于冷冻干燥生物样品的装置，其包括a)用于存放生物样品的存放器，该存放器位于密闭腔室中；b)位于密闭腔室内用于冷却腔室的冷凝器；c)与腔室连通并与真空源连通的入口；d)其中密闭腔室限定通过真空源降低压力的区域，并且密闭腔室具有小于2升的容积。在一些实施方式中，密闭腔室的内部容积等于或低于1.5升，并且一些实施方式等于或低于1升。

根据本发明的另一个方面，提供了冷冻干燥在分开的装置中含有的多个生物样品的方法，其包括a)将含有第一生物样品的第一装置放置在第一容器中，该第一容器在其内含有低温流体；b)将含有第二生物样品的第二装置放置在其内含有低温流体的第一容器中；和c)启动真空泵以降低第一装置的第一腔室中的压力，而不向第二装置中的第二腔室施加真空。

在一些实施方式中，方法包括关闭对第一腔室的真空并且将来自同一真空泵的真空施加至第二腔室同时将第二装置保持在低温流体中的步骤。第一装置和第二装置可以具有阀以选择性地打开和关闭真空。

生物样品可以包括干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、来自人源或动物源的诱导的多功能干细胞、精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织或睾丸组织的一种或多种。

附图说明

为了使本发明所属领域的普通技术人员更容易地理解如何制造和使用本文公开的外科设备，以下将参考附图详细地描述其优选实施方式，其中：

图1是根据本发明的一个实施方式的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的示意图；

图2是根据本发明的另一个实施方式的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的示意图；

图3是根据本发明的另一个实施方式利用主动冷却的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的侧面透视图；

图4是根据本发明的另一个实施方式利用被动冷却的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的侧面透视图；

图5是利用被动冷却的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的替代实施方式的侧视图；

图6是用于改变低温流体容器内冷凝器的高度的提升元件的侧视图；

图7是根据本发明的另一个实施方式的用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置中容器和冷凝器的上部的剖视图；

图8是具有用于存储生物样品的两个托盘的本发明的容器的替代实施方式的剖视图；

图9a和9b是用于存储生物样品的本发明的容器的另一个实施方式的透视图；

图10a是用于存储生物样品的本发明的容器的另一个实施方式的侧视图；

图10b是用于冷冻干燥生物样品的装置的另一个实施方式的侧视图；

图10c是显示在液氮容器中的装置的另一个实施方式的剖视图；

图10d示出了图10c的装置的内部组件；

图11a是用于冷冻干燥样品的系统的图；

图11b是用于冷冻干燥样品的装置的框图；

图12示出了根据本发明的方法的一个实施方式的用于冷冻干燥精子样品的系统；

图13a示出了根据本发明的另一个实施方式的用于冷冻干燥生物样品的系统。

图13b是描绘根据图13a的方法冷冻干燥生物样品的全部步骤的流程图；

图14示出了根据本发明的一种方法再水化生物样品的方法。

图15是显示根据图13a和14的方法描绘的冷冻干燥工艺和再水化的步骤的流程图；

图16显示了根据本文所述的测试的辐射的冷冻精子(左)和辐射的冷冻干燥精子(右)的空心精子染色；

图17示出了根据本文所述的测试，对于新鲜对照和冷冻干燥的组织在再水化和用苏木精-伊红染色之后的结果；

图18显示了冷冻(a、b)和冷冻干燥(c、d)的样品的显微图像；和

图19显示了在lyo溶液中冷冻的扫描电子显微镜图像。

具体实施方式

本发明提供了用于冷冻干燥生物样品的装置和用于这种冷冻干燥的方法。生物样品可以是哺乳动物细胞或组织。生物样品可以包括，例如，来自人源或动物源的卵母细胞、胚胎、精子、生殖组织、卵巢组织、子宫组织、睾丸组织、干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导的多功能干细胞等。本发明还提供了用于冷冻干燥工艺之后对样品进行再水化。

本发明的装置有利地在密闭腔室内进行升华而不损坏其内含有的生物样品。在其中升华过早开始的工艺中，它将对样品具有负面影响。本发明的装置利用小体积并在较短的时间内达到所需的真空压力，从而可以实现升华而不损坏样品。此外，本发明的装置具有保持无菌的优势。由于其尺寸，该装置可以放置在消毒器中。另外，由于其尺寸和降低了装置成本的简单性，在某些实施方式中，该装置可由一次性材料形成，以在使用后处置。

本发明的冷冻干燥装置创建了密闭腔室，该密闭腔室具有冷凝器以便降低腔室内的温度，真空以便降低密闭腔室内压力以及加热器(与冷凝器间隔开)以加热容器内生物样品以便进行升华工艺，以下将对所有进行详细描述。这也在以下详细讨论的图11a和11b的图中显示。

本发明的方法使用装置以便冷冻干燥样品，随后在需要使用时再水化。以下详细描述各种方法，其中一些测试结果的实例显示了本发明的冷冻干燥方法的附带的有利结果。

首先，将结合图1-10d讨论用于冷冻干燥生物样品的装置。图1-5示出了用于支撑和冷冻干燥(例如，冻干)一种或多种生物样品的各种实施方式。在以下描述中，除非另外特别指出，一个以上附图共有的组件将用相同参考数字提及。另外，除非另外特别指出，在本说明书中描述或提及的实施方式可以是其中描述或提及的任何其他实施方式的附加和/或替代。

在这些装置中，提供了两个内部容器：一个支撑(存储)生物样品(一种或多种)并且一个含有冷凝器。两个容器的内部空间连通并一起形成密闭的内部空间，也被称为密闭腔室，其与外部环境隔绝。将真空施加至密闭的内部空间以降低空间内的压力。通过被动冷却或主动冷却(其二者将在以下描述)将装置冷却以降低温度。将样品存放在容器内的小瓶或其他存放器中并通过各种方法加热。利用这些特征，实现升华而不损坏样品。

用于冷冻干燥样品的装置

首先转到图1的实施方式，示意性地示出了用于冷冻干燥(冻干)一种或多种生物样品102的装置，并用参考数字100表示。该装置包括具有内部空间110的样品支撑或样品存储(存放)容器104。为了便于说明，样品存放容器104在本文中也将被称为具有“第一内部空间的“第一容器””。在该实施方式中，冷凝器106位于容器104下方并且具有内部空间112。为了便于说明，冷凝器106内的空间112也将被称为第二内部空间112。第一内部空间110和第二内部空间112在它们经由第一联接元件108联接以一起构成“密闭的内部空间”时处于流体连通。因而，密闭的内部空间由第一容器104、冷凝器106和联接元件108的内部空间限定。如所显示，联接元件108在容器104和冷凝器106之间形成较窄的通道，然而，可以可选地提供其他形状和尺寸。

冷凝器106被联接至真空泵114——配置为从密封的容积(或者，换句话说，密封的空间)去除气体分子以便将该密封的容积转变成部分真空的装置。泵114到冷凝器106的联接是经由冷凝器106中的开口116实现的，泵114经由第二联接元件或连接管118联接至该开口116。可以利用各种类型的泵。在一些实施方式中，例如，真空泵将真空降低至低于1托。联接118提供从泵114至冷凝器106的通道。在图1的实施方式中，真空泵114直接联接至冷凝器106，即，真空泵114经由冷凝器的壁中开口116联接，并影响冷凝器106的第二内部空间112中的压力。由于第二内部空间112形成密闭的内部空间的部分，真空泵114影响密闭的内部空间中的压力，该密闭的内部空间包括与第二内部空间112连通的第一内部空间110。因此，真空泵114被认为是与第一容器104间接联接。也就是说，真空泵114可以被认为直接联接至第二内部空间112并间接联接至第一内部空间110。

应当领会，在替代实施方式中，真空泵114可以直接联接至第一容器104同时经由联接元件比如第一联接元件108间接联接至冷凝器106，该第一联接元件108将与第一容器104中的开口连通并且将与冷凝器的开口连通。真空泵114也可以可选地经由联接元件108中的开口安装至第一联接元件108，其中该真空泵114将被间接联接至第一容器104和冷凝器106二者。然而，在这些变型的任一种中，由于第一和第二内部空间连通，真空泵与密闭的内部空间的任何部分的连接就实现了转变密封的容积，即，降低密闭的内部空间内的压力的预期目的。

第一容器104配置为存储一个或多个生物样品102，在本文中简称为“一个样品”或“多个样品”。也就是说，在本文的描述中，当在第一容器或其他存放器/载体的讨论中使用术语“样品”时，应当理解，也可以考虑多个样品，以便为了理解本文的装置和方法的功能和目的，术语“样品”应当被解释为是指单个样品或多个样品。

在图1中，举例而言示出了三个样品，但这是非限制性的并且可以将任何适用数量的样品存储在第一容器中并由装置100冷冻干燥，比如一个样品、2个样品、4-10个样品或任何其他适用数量的样品。也就是说，第一容器104可以配置为根据期望/需求存储一个样品或多个样品(即，一个或多个样品)。可以通过任何适用的方法将生物样品放置到装置中以将它们保持在第一容器104内，并保护它们免受由温度或负压或甚至机械损坏引起或产生的损坏。可以将样品放置在小瓶内，比如玻璃小瓶、冷冻小瓶或如本文所述允许热量从加热器传递到存放器并通过小瓶传递至样品以促进升华的其他类型的小瓶。也可以将样品放置在预冷却的金属表面上，该预冷却的表面位于装置中或者可选地在装置之外，之后将样品沉积在装置中放置的所述表面上。在放置在装置内之前，可以将小瓶预冷却。

可以通过各种方法比如通过经由红外灯辐射或通过其他能量来源(例如，电加热、射频等)将小瓶内的样品加热以便进行升华。还提供并例如在图1中示意性地示出了用于测量温度的热电偶和用于控制温度的控制器。热电偶、控制器和加热器也适用于本文公开的其他装置，虽然仅结合图1示意性地显示。

图2是用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的替代实施方式的示意图。装置200具有样品支撑(存放/存储)容器202(在本文中也被称为第一容器202)和在图2的视图中位于第一容器202下方的冷凝器204。在该实施方式中，第一容器202直接联接至冷凝器204，即，其不具有如图1所示将第一容器和冷凝器分开的联接(连接)元件108。与在图1的装置100中一样，第一容器202内的空间构成第一内部空间206并且冷凝器204内的空间构成第二内部空间208，其一起形成密闭的内部空间或腔室。然而，与图1的装置100不同，在装置200中，第一内部空间206直接联接至第二内部空间208，形成密闭的内部空间。也就是说，在该实施方式中，在没有联接元件比如图1中的联接元件108的情况下进行联接。

装置100和装置200二者均示出了干燥-冷冻一种或多种生物样品的实施方式。除非如本文中所指出，当提及装置100或装置200(以及图1或2，或其构件)时，适用于其的任何内容也适用于其他装置(或图或构件)。例如，如果参考第一容器104提供了某种解释，那么该解释也适用于第一容器202，参考冷凝器204也适用于参考冷凝器106，参考第一内部空间110适用于第一内部空间206等。

与容器104一样，容器202以及本文公开的用于支撑生物样品的任何其他容器配置为支撑(存储)一个或多个样品，例如，1-10个样品。

与图1的冷凝器106类似，图2的冷凝器204可以直接或间接联接至真空泵114。在图2中，它显示为经由第二联接元件118直接联接至泵114，该第二联接元件118提供从泵114经由开口116至冷凝器204的通道。

与容器104一样，通过比如本文公开的那些的各种方法加热容器202中的以及在本文公开的其他容器中的生物样品。

通常，根据本文公开的本发明的实施方式的装置包围与该装置所处的外部环境隔离的密闭的内部空间。以这种方式，防止了来自外部环境的空气或任何其他气体渗透到密闭的内部空间。另外，除非被泵114泵出，限制在装置的密闭的内部空间内的气体被阻止离开密闭的内部空间并进入到外部环境。因此，为了进一步从密闭的内部空间泵出气态内容物，密闭的内部空间内的压力变得小于外部压力。例如，如果外部压力是大气压，那么由于施加真空而密闭的内部空间内的压力将变得低于大气压。因而，密闭的内部空间将变成部分真空。为了简单起见，将由从其中泵出气态内容物所导致的密闭的内部空间简称为“真空”。

当压力和温度低于物质相图中物质的三相点(其被定义为在热力学平衡中三相共存的点)时，发生升华-直接从固相转变为气相，而无需经过中间液相。生物样品比如一个或多个样品102(或样品210)包括水。因此，根据本发明的实施方式，如果密闭的内部空间中的压力和温度足够低以使得水升华，那么样品将变干。因此，鉴于密闭的内部空间内的温度，真空泵应当运行直到压力和温度低于水的三相点。因此，真空泵优选地配置为将压力降低至如此压力以允许升华。注意，为了发生升华，它必须在水的三相点以下，但是由于它是吸热过程，因此需要热量。

然后，当样品(一个或多个)中发生水的升华时，将有可能在冷凝器中冷凝(或者甚至沉积)水蒸气，此后将第一容器(比如容器104或202)与冷凝器(比如冷凝器106或204)分开并且密封第一容器以防止湿气从环境进入，从而将干燥的样品(一个或多个)保留在第一容器中。

图3示出了用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置的替代实施方式。装置300包括样品支撑(存放)容器302(在本文中也被称为第一容器)，显示在容器302和出口306下方的冷凝器304。装置300是图2的装置200的类型，因为其第一容器302直接联接至冷凝器304，然而，它与装置200的不同之处在于出口306位于第一容器302中而不是位于冷凝器中。因此，可以类似于图2的泵114的真空泵314(示意性地显示)可直接连接(联接)至存放样品的第一容器302并且可间接连接至冷凝器304。容器302和冷凝器304各自具有内部空间，其一起形成密闭的内部空间或密闭腔室。

装置300包括内部冷却机构308。内部冷却机构包括冷却盘管310和冷却器单元312。冷却机构308可以是当前市场上的机构，例如，thermoscientific^tm的ek^tm浸入式冷却器。在图3的实施方式中，冷却盘管310可以在冷凝器304的外部并且在腔室之外，并且冷却器单元312可以在冷凝器的外部并且在该实施方式中显示为在盘管310的下方。因此，内部冷却机构308需要贯穿装置300的壁。由于在真空泵运行时，密闭的内部空间变得部分真空，贯穿的壁需要被密封并且抵抗低压条件和低温条件，否则在内部冷却机构运行时会出现故障。失败的贯穿将导致恶化低压的产生，丧失低压条件和升华停止。此外，失败的贯穿也可能损坏样品和/或低温流体的无菌性，但这将在以下讨论。注意，外部放置冷却机构导致冷凝不在盘管上而是冷凝仅在壁上。

如以上所提及，样品支撑容器104、202以及相应地还有样品支撑容器302和本文公开的其他样品支撑容器可以与冷凝器分开并且密封以便在部分真空中保存干燥的生物样品。在这种分开并且还断开真空泵314之后，为了密封第一容器104、202或302或其他样品支撑容器，出口306也需要被密封。因此，装置300包括阀314，该阀314可以在泵断开之前关闭，从而在含有生物样品(一个或多个)的容器内保持低的压力。在各种实施方式中，可以利用各种类型的阀来密封出口。

阀也可以与本文的其他实施方式一起使用以维持压力。也就是说，阀(一个或多个)还可以与定位在装置的其他部分的出口一起使用，比如冷凝器(例如，冷凝器106、204、304)中或第一联接元件108中的出口。

如以上所解释，装置300具有贯穿装置的壁的冷却机构308。回到图1的装置100和图2的装置200，可以使用不需要贯穿装置的壁的替代的冷却方法。在该替代的方法中，将装置的冷凝器(以及在一些实施方式中，还包括样品支撑/携带容器)插入到含有低温流体的容器中。注意，可以使用各种低温流体。因而，虽然以下描述主要涉及液氮的使用，但应当理解，这是非限制性的，因为可以可替代地使用液体空气以及其他低温流体，比如二氧化碳、氮气浆等。

注意，冷凝器和含有样品的第一容器不需要浸没在液氮中，只要低温流体容器内的温度和密闭的内部空间的低压力低于水的相图中水的三相点即可。图4和5示出了利用低温流体进行冷却而不需要冷凝器与流体直接接触的实施方式。

注意，使用液氮可以将样品保持在低于其玻璃转化温度的低温度，并且冷凝低于该玻璃转化温度。同样，在装置放置在液氮容器内的情况下，液氮保留在腔室外。

转到图4，冷冻干燥装置总体上用参考数字400表示。装置400是与图1的装置100类似的装置类型，因为样品存放容器和冷凝器直接联接，因为装置400包括将第一容器404(其含有样品)联接至冷凝器406的联接构件402。这种联接将第一容器404内的第一内部空间408与冷凝器406内的第二内部空间410连接。装置400显示具有第一容器404以及插入到液氮容器412(或存放其他低温流体的容器)中的冷凝器406，该液氮容器412的液氮液位描绘为418。如所示，冷凝器406和第一容器408都没有浸没在液氮中，因为它们位于流体线418上方。液氮容器412内的低温是液氮固有的，因此通过将装置400暴露于该固有的低温来被动地促进冷却。这不同于主动冷却，主动冷却需要能量(比如电能)的投入以便例如通过冰箱或通过冷却器单元比如图3的单元312来冷却环境。

冷凝器410的壁中的出口416用于联接类似于泵114的真空泵414(示意性地显示)，其中出口416位于液氮容器414的外部。联接元件118将泵414连接至出口416。在液氮容器412的外部，出口416和泵414不暴露于与液氮容器414内部的温度一样低的温度，这简化了冷凝器内部空间410和泵414之间通道的密封。可以在出口416处提供用于关闭真空的阀。

在替代实施方式中，管可以从真空泵延伸至存放样品的容器，并且管可以绕成圈并穿过液氮或其他冷却流体以冷却腔室。可以将金属球放置在由塑料组成的管内。因而，冷却的管用作冷凝器。这减小了装置的整体尺寸。

在替代实施方式中，代替将冷凝器和含有生物样品的容器(第一容器)插入到液氮容器，将冷却盘管缠绕在冷凝器416周围。然后，通过运行联接至冷却盘管的冷却器单元，冷凝器416从外部被冷却，从而依赖于冷凝器的壁的热传导也冷却冷凝器内的第二内部空间410。在这种实施方式中，与依赖于被动冷却的图4的实施方式不同，这依赖于主动冷却，需要投入能量以便使冷却盘管冷却。

应当领会，其中样品存放容器直接联接至冷凝器的图2的装置200类型的装置也可以通过液氮(或其他低温流体)冷却，如图4的实施方式所示。图5示出这种冷却的实例。图2所示类型的冷冻干燥装置500具有支撑/存储样品的第一容器502和冷凝器504。将装置500插入到液氮容器506。参考数字508描绘容器506内的液氮液位以示出装置500没有浸没在液氮中。类似于装置400，装置500也是通过容器506内液氮的固有低温被动冷却。在装置500中，出口510位于容器502的上壁，并且包括阀512。联接元件118将类似于泵114的真空泵(未显示)联接(连接)至出口510以便将真空施加至由容器502中的内部空间和冷凝器504中的内部空间限定的密闭的内部空间。

提供提升元件514以将装置500定位在液氮液位508上方。提升元件514包括支柱以将冷凝器504与液氮容器506的底部分离(分开)。提升元件的另一个实施方式在图6显示并由参考数字600表示。该提升元件600可以用于支撑和提升图5的装置500或其他装置以使冷凝器和样品存放容器不与低温流体直接接触。

提升元件600包括外部构件602、具有螺旋或螺丝606的内部构件604和活塞608。当内部构件604经由螺丝606的外螺纹与外部构件602的内螺纹的啮合进入外部构件602时，可以旋转活塞608以便通过减小内部构件604的暴露长度提升或降低内部构件604。还可以考虑提供内部构件的伸缩布置的其他结构以实现提升元件的高度调节。

提升元件600配置为支撑用于冷冻干燥一种或多种生物样品的装置。因此，其被设计成放置在冷凝器下方，例如，上述冷凝器106、204、50或其他冷凝器下方，以允许改变液氮容器内的冷凝器的高度，使得在一些实施方式中，它可以被升高至低温流体液位上方的高度，因此它不会与流体接触。提升元件600可以任选地具有支撑元件610，其可与冷凝器的接收部分例如狭槽或其他结构啮合以用于另外的支撑。提升元件514和600以及提升元件的替代形式可以是固定的高度，或者是可调节的以支持不同的高度以便调节至含有低温流体的容器内的低温流体的不同液位和/或调节至流体液位上方的不同距离。还考虑了其他形式的提升元件。例如，图3中显示的支架314可以提供为提升元件以将容器安装在低温流体线上方(与低温流体线分开)。调节提升水平以及因此调节与液氮的距离可以调节/改变冷凝器和样品的温度。

还考虑了，代替将装置500插入到液氮容器或含有另外的低温流体的容器，可以用冷却盘管将其缠绕，从而主动冷却装置，而不是通过液氮或其他低温流体对其进行被动冷却。

为了促进以允许来自一个或多个生物样品的水有效升华的速率升华，可以利用各种形成的能量。在图4和5的实施方式中，将含有样品的容器504和502的上部暴露于外部空气，该外部空气的温度预期显著高于液氮容器内液氮液位上方的温度。然而，也考虑了达到较高温度的其他方式，并且为了升华，可以向容器提供主动施加的热量。例如，在图7的实施方式中，用于冷冻干燥生物样品的装置包括用于存放样品的第一容器704和冷凝器706(显示了上部)。环或其他结构形式的加热元件可以定位在外部以围绕容器，并且温度由热电偶测量并由温度控制器控制。当加热元件运行时，它提供升华所需的能量。加热元件可以与容器相邻或接触，并且可以围绕整个圆周周向延伸，或者可选地，它可以延伸小于全圆周。应当领会，还考虑了包括其他配置的其他形式的加热元件。显示了在容器704的狭槽或空腔内的硅树脂o形环形式的密封702以密封容器用于真空。

为了允许图7中的升华，应当领会，一个或多个生物样品应当暴露于容器704的第一内部空间708的内部环境，该内部环境与冷凝器的内部空间连通在一起，形成密闭的空间或腔室。也就是说，当密闭的空间内的温度降低时，样品应当暴露于该降低的温度，当密闭的空间内的压力降低时，该样品应当暴露于该降低的压力，等等。因此，样品应当储放在第一内部空间，暴露于内部环境且未被其屏蔽。因此，在图7中，托盘710具有多个空腔712。每个样品可以未被屏蔽地直接放置在空腔712中，这意味着它们每个暴露于内部空间内的环境。应当领会，如本文所讨论，样品可以存储在放置在空腔中的小瓶中，其中小瓶暴露于容器的第一内部空间的内部环境，与冷凝器的内部空间连通，或者可选地可以将样品直接放置在空腔中(不用小瓶)。

在一些实施方式中，比如在图7和8的实施方式的装置中，该装置由一次性材料组成，所以它是一次性的。将样品放置在一次性的存放器中并且可以例如通过辐射或其他方法从顶部加热。在其他实施方式中，比如图1、2、10c和10d的实施方式，该装置不是一次性的而是可消毒的，并且将含有样品的小瓶放置在金属存放器中，该金属存放器与容器的壁接触并且随着壁被加热而被加热。

图8示出了用于存储样品的替代容器(第一容器)的一个实施方式。容器800具有两个堆叠的托盘802、804，每个具有多个空腔。更具体地，上托盘具有周向布置的一系列空腔805并且下托盘804具有周向布置的一系列空腔807。为了清楚起见，在附图中仅标记了每个托盘804、802的空腔中的一个。联接元件806提供从容器至真空泵的连通并且可以包括阀。应当领会，在其他实施方式中。可以具有两个以上的托盘或仅一个托盘，并且托盘可以是其他配置。注意，本文公开的其他容器也可以具有多个托盘，例如，具有用于存储多个生物样品的多个空腔的彼此堆叠的托盘。样品可以如本文所述地放置在小瓶中或者直接放置在托盘上。

在图9a和9b的替代实施方式中，代替如装置800中那样在容器内存放一个或多个托盘，容器900的底壁902用作用于存放生物样品的托盘。如所显示，底壁902具有用于存放样品的多个空腔904。可以如本文所述将样品直接放置在空腔中。(注意，在其他实施方式中，可以将样品放置在小瓶中并将小瓶放置在存放器中，比如在图7和10c的实施方式中)。显示了出口905从容器的底壁902延伸并且经由联接元件(例如，管)906连接至泵以施加真空至由容器900的内部空间和冷凝器(未显示)所形成的密闭的内部空间。

图10a示出了用于存放样品的容器的替代实施方式。容器1000具有放置在其上的盖子1002，并且盖子的边缘焊接至容器壁的边沿，如箭头1004所示。出口由参考数字1006表示，并且从出口1006延伸的管1008用作与真空泵连通的第二联接元件(类似于上述的联接元件118)。在干燥样品之后并且在断开与联接管1008连接的真空泵之前，为了密封含有干燥的样品的容器1000，可以将管1008焊接，如箭头1004所示。还可以将管1008密封，优选地在狭窄区域，比如在图8的管806中。可以领会，可以以类似的方式在干燥后将本文公开的其他容器中含有的样品密封，例如，通过密封盖子和管，或通过其他密封方法以维持密闭的环境。

图10b示出了本发明的冷冻干燥装置的替代实施方式，由参考数字1050表示。装置1050可以在冷冻干燥之前被灭菌并且可以由不锈钢制成。装置1050由液氮(或其他低温流体)冷却并且具有温度控制——压力或温度监测器/仪表1054，带有用于真空的阀的管道1052和用于密封装置1050的内部腔室或密闭的空间内的生物样品的顶盖1056。

在图10c和10d的实施方式中，装置1060具有真空泵入口1066、管状构件形式的用于生物样品和冷凝器1062的温度调节架1064。装置1060放置在含有液氮1070的ln杜瓦瓶1068内以如本文所述随着施加真空而降低密闭腔室内的温度。

应当注意，图7-10d的实施方式的容器可以用在本文公开的其他装置中，例如，图1的装置100类型的装置和图2的装置200类型的装置。

应当领会，用于存储样品的容器可以是各种形状/配置，并且举例而言在图8-10d中显示为圆盘形。

如以上所解释，用于冷冻干燥一个或多个样品的装置包括密闭的内部空间。第一容器和冷凝器配置为防止密闭的内部空间与外部环境之间的颗粒交换，因此在致动真空泵之后，密闭的内部空间变成部分真空。然而，除了促进低压产生之外，防止颗粒交换也促进了灭菌：来自密闭的内部空间的颗粒(在污染的一个或多个样品的情况下)不能穿过并到达寒冷环境，同时来自寒冷环境的污染的颗粒不能穿过并进入密闭的内部空间。

甚至进一步地，应当领会，用于存放样品的容器和/或冷凝器和/或连接容器和冷凝器的联接元件(在其中提供联接元件以将容器和冷凝器联接的实施方式中)可以由不同的材料制成，不同的材料是聚合物和/或金属，其中所使用的材料在结构上耐低压以便防止在低压下弯曲，因而避免使生物样品面临机械损坏的风险。

在本文所述的实施方式中，冷凝器或者通过例如液氮(或其他低温流体)容器被动冷却，或者通过例如冷却元件主动冷却。从而紧邻冷凝器外部的环境构成“寒冷环境”，其中当冷凝器位于低温流体容器内而不位于低温流体本身中时，或者当如果冷凝器浸没在流体中冷凝器位于低温流体本身中时，或者当紧邻的环境被冷却盘管冷却等时，寒冷环境可以是冷却冷凝器的低温流体的蒸气。

装置具有足够小的尺寸/容积，使得可以在非常短的时间内达到密闭腔室内的真空压力。例如，在一些实施方式中，在短的时间段内，例如，在不到10分钟内，或者在更少的分钟内以及在一些实例中在几秒内压力可以达到小于1托，甚至0.5托，或者甚至小于0.5托，因为容积可以小至2升或者小至1.5升，或者更优选地小至1升，或者甚至小至0.5升。因而，当压力降低至1托或0.5托时开始升华以带走或减少可能不利地影响样品的冰晶。也就是说，内部空间的小容积，即，其中经由真空泵降低压力的空间的小容积，使得能够以快速方式达到所需的压力。这使得能够更快速地开始升华。

在一些实施方式中，可以通过将冷凝器和样品存放器放置在同一腔室中达到腔室的小容积。

进一步地，由于小容积和快速的冷却和升华，样品和冷凝器在同一腔室中相对靠近在一起。例如，在一些实施方式中，从样品到冷凝器(冷却元件)的距离可以短至10cm，或优选地短至2cm，虽然也可以考虑更小和更大的距离。即使当样品被加热以便升华时，这种短距离仍然能够实现所需的冷冻干燥。

如本文所指出，在一些实施方式中，装置可以是台式尺寸，其允许放置在高压釜中进行灭菌。在这些实施方式中仅由金属组成，这种灭菌可以在损坏内部组件的情况下进行。另外，由于在一些实施方式中，可以将装置放置在液氮中以降低温度，而不是利用冷却单元，因此可以避免容器内的非金属组件，比如管道，以便能够进行灭菌。

注意，装置可以是足够小的尺寸以促进便携性，这对于液氮浸没和/或灭菌可能是有利的。

由于以上讨论的原因可以实现的装置的小尺寸，在一些实施方式中，考虑了可以将多个装置插入到同一液氮容器中。每个装置具有压力监测器和用于与真空泵(其可以是用于多个装置的同一真空泵)连通的连接器，以及打开和关闭向装置内的腔室施加真空的阀。因此，当将多个装置放置在ln容器(或其他低温流体的容器)内时，不需要同时为所有装置启动真空，因为可以独立控制向每个装置的腔室施加真空。因此，同一真空泵可以用于所有装置，但不需要同时向装置施加真空，因为当特定装置不需要真空时，可以关闭所需装置的阀。

注意，一个或多个样品可以存放在每个装置中，例如，装置可以存放4个小瓶，或者6个小瓶或另外数量的小瓶。

用于冷冻干燥样品的方法

现在将描述用于冷冻干燥生物样品的方法，该生物样品是哺乳动物细胞或组织。

干燥在各种应用中的优势是已知的，比如食品保存技术。除了食品工业(例如，速溶咖啡、牛奶和鸡蛋粉、干酵母等)之外，干燥还用于药物、细菌、病毒、真菌和酵母制剂。干燥工艺可以描述如下。在性质上，干燥是被称为脱水生活或无水生活的过程。脱水生活是一种极度脱水的状态，其中有机体显示无可检测的新陈代谢，但保留了再水化之后复活的能力。在干燥状态下保存在植物(种子)和许多原核生物中非常普遍，但也可以在某些真核生物中发现，包括轮虫、缓步动物、线虫、甲壳动物、昆虫等。它们所有的共同点是，它们相对较小，它们对于身体水分的流失很少或没有控制，并且它们通常居住在短暂潮湿的栖息地。它们在不同的发展阶段干燥。在没有水的情况下，不会发生生化反应，新陈代谢降低到可检测水平以下，没有水会冻结或沸腾，并且没有活跃的细胞进程被中断，因此它们可以承受各种极端环境。脱水生活使得动物在没有水的情况下长期生存，有效延长了它们的寿命，并在最合适的条件下促进繁殖或发育。水的流失是逐步且缓慢的，使得大量的膜、蛋白质和核保护剂的积聚达到其干重的50％。这些保护剂包括二糖(主要是海藻糖)、胚胎发育晚期丰富(lea)蛋白、酸酐、热激蛋白等。

本发明提供通过冷冻干燥精子细胞、卵母细胞、胚胎和生殖组织比如卵巢组织、子宫组织和睾丸组织的干燥。本发明还提供了通过冷冻干燥来自人源或动物源的干细胞、造血干细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、诱导的多功能干细胞的干燥。本发明的这种冷冻干燥也可以用于红血细胞或细胞系。将生物样品浸入特殊的冷冻干燥溶液(一种或多种)中，然后使用本文结合图1-10d和12-13所述的设备冷冻并干燥。在冷冻干燥之后在进行随后的再水化的结果使得可用于辅助生殖技术比如体外受精(ivf)、卵母细胞胞质内单精子注射(icsi)、包括植入前基因筛查(pgs)的基因筛查、包括植入前基因诊断(pgd)的基因诊断测试等。

现在将描述本发明的成功冷冻干燥配子和生殖组织的完整方法。它包括用于这种目的的溶液和冷冻干燥装置，比如以上所述和图1-10d和12-13所示出的装置。本发明提供了冷冻工艺和干燥工艺。本发明还提供了冷冻干燥工艺之后的再水化工艺。配子和生殖组织可以用于art，其包括但不限于冷冻保存、繁殖能力保存、ivf、icsi、pgd、pgs等。这种技术提供了在安全条件下长期存储细胞和组织的有效方法。

因此，本发明提供了用于冷冻生物样品比如精子、卵母细胞、胚胎、卵巢组织、子宫组织、睾丸组织等的组合物，其包括基于糖类比如蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、葡聚糖和海藻糖和冷冻保护剂(cp)比如二甲亚砜(dmso)、乙二醇(eg)、丙二醇(pg)和大分子和蛋白质比如人血清白蛋白(hsa)、胎牛血清(fcs)、lea蛋白质和抗氧化剂比如虾青素、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、抗坏血酸的冷冻干燥溶液(冻干(lyo)溶液)。lyo溶液可以组合使用，即dmso和hsa和缓冲溶液比如tcm199、tris、pbs或hepestalp、rpmi-1640、达尔伯克氏改良伊格尔培养基或本领域已知的任何其他缓冲溶液。lyo溶液可以由例如dmso和碳水化合物或dmso和蛋白质组成。

已经发现，当与蛋白质一起使用时，dmso提供良好的冻干溶液，因为它在19℃结晶时升华。当其结晶时，可以进行升华。在升华之后，所得的材料通常不包括dmso，然而，即使留下了残余的dmso(由于水的升华)，如果保持在19℃以下，它仍然是固体，因而不会影响样品，例如，细胞。注意，如果其是100％的dmso，dmso将在19℃下结晶，但对于较低百分比的dmso的溶液，例如，5％或10％，如在本发明中所使用，通过冷冻将其分离并且然后升华，剩下的是dmso，这样它就会结晶。

可以以各种方式收集细胞和组织。举例而言，可以经由本领域已知的任何方法收集精子细胞，包括，但不限于，射精、电诱导射精、睾丸精子抽吸(tesa)、活检、精原细胞的体外成熟。举例而言，可以通过取卵、活检、卵泡体外成熟恢复卵母细胞。举例而言，可以通过ivf手段获得胚胎或者可以从子宫收集体内产生的胚胎。可以经由例如活检、经阴道活检、腹腔镜、剖腹手术和卵巢切除术后获得卵巢组织。举例而言，可以通过活检、经阴道活检、腹腔镜、剖腹手术和子宫切除术后获得子宫组织。可以例如，经由活检获得睾丸组织。注意，举例而言提供上述内容，因为也考虑了收集生物样品即细胞和组织的其他方式。

在获得生物材料(样品)之后，然后基于其来源对其进行评估。例如，通常对精子细胞进行计数并评估其形态、生存力和运动性，通常对卵母细胞和胚胎进行计数和评估其形态，可以对组织进行活/死染色或仅通过形态评估。无论使用哪种方法评估细胞和组织，然后都将生物样品浸入在本文所述的冷冻干燥溶液(lyo溶液)中。因而，如以下所更详细描述，该方法提供了在处于lyo溶液中之后冷冻细胞和组织。

综上所述，该方法提供了低温脱水工艺，其涉及冷冻样品、降低压力并且通过升华去除冰。

首先，将参考图12讨论精子的冷冻，接着讨论胚胎和卵母细胞的冷冻，然后讨论干细胞的冷冻以提供本发明工艺的实例。

精子的冷冻

冷冻参数在图12中示出，其中包括用参考数字1表示的精子样品，其浸入在具有小体积的冻干(lyo)溶液中并沉积在冷冻干燥装置7的预冷却的金属表面2上。在图12中，金属表面2是装置7的一部分，然而，在其他实施方式中，可以将精子样品(一个或多个)沉积在装置之外的冷却表面上，然后将该带有样品的冷却表面放置在装置内。可以通过使用移液管3移液或者通过产生所需的体积——优选地小于200μl的体积——的任何其他方法制成液滴，以便放置在金属表面上。在较低精子计数的情况下，表面比如盖玻片或塑料表面比如cryotop(日本kitazato)可以用记号笔4标记以促进在冷冻干燥工艺之后进行再水化时定位精子。可以在冷冻之前将液滴放置在小的表面比如玻璃或塑料表面上或可以将液滴直接冷冻在金属表面上并在冷冻之后可以收集到维持在相同温度的玻璃小瓶中。通过表面温度和液滴的体积确定冷却速率。在关于精子的一个实例中，通过使用冷却在维持在高负温(-20℃至-50℃)的表面上的小液滴(例如，10-20μl)或者冷却至-50℃和ln或液态空气温度之间的温度的更大体积例如(20-200μl)而使用快速冷却速率。

卵母细胞和胚胎的冷冻干燥/玻璃化&干燥

图13a中和图13b的流程图中示出了卵母细胞和胚胎的冷冻。可以将卵母细胞或胚胎放置在具有特殊荚(也称为胶囊)的吸管12中，如pctwo/2017/064715a1中所述，其全部内容通过引用并入本文。通过将吸管内的细胞逐渐暴露于含有冷冻保护剂比如dmso、eg或pg和蛋白质比如tcm培养基中的has的lyo溶液完成冷冻。这种lyo溶液的实例可以是由10％(v/v)dmso、tcm培养基中10％(w/v)has组成的溶液。这种溶液可以称为100％lyo溶液。如图13a所描绘，通过几个渐进步骤例如2-6个步骤的逐步浸没在存放在单独容器中的lyo溶液逐渐增大的溶液中完成暴露。例如，第一步可以是放置在含有25％lyo溶液的容器或存放器15中。在指定时间段之后，然后将含有生物样品(卵母细胞或胚胎)的吸管或其他样品存放器13从容器15去除并放置在含有50％lyo溶液的容器或存放器16中。然后将吸管13去除并放置在含有75％lyo溶液的容器或存放器17溶液中，并且最后从容器17去除并放置在含有100％lyo溶液的存放器或容器18中。每种溶液的暴露时间可以是室温(rt)下1至3分钟之间，虽然也考虑其他时间段和/或温度。应当领会，举例而言提供了以上列出的百分比lyo溶液，因为可以使用其他百分比。另外，举例而言显示了四个容器，因为也可以利用具有不同lyo溶液的更少或更多数量的容器。这在图13b的流程图中呈现，其中将样品浸入在溶液1、溶液2…溶液n中，其中n表示lyo溶液的一系列容器1-n的最后的容器。在从容器18抽出后，将存放器(吸管)13插入ln杜瓦瓶19中含有的无菌液态空气20中或者可选地快速插入液氮(ln)容器中(图13a中未显示，但在图13b的流程图中呈现)。可以根据美国专利号9,890,995(由以色列fertilesafe生产为clair装置)中描述的方法产生无菌空气。随后，将存放器13从ln杜瓦瓶19去除并且放置在为以上参考图1-10d所述类型的冷冻干燥装置的装置21中。该步骤在图13b的流程图中描绘。装置21具有低于溶液的玻璃转化温度(tg)的搁板温度，例如，90℃，其由加热器22和冷凝器23控制，该冷凝器23与放置到ln容器24中的上述装置例如装置100、200等一样设置在装置21的较低温处。注意，如图13a中所示以及如以上所述，优选地，吸管12内的样品13在容器24的液氮液位上方。连接器25将真空泵与装置21的内部空间连接以降低密闭的内部空间(腔室)的压力。向吸管12内的样品提供热能来源，其可以是加热器22或其他加热源，例如，辐射，例如，红外灯。

注意，在玻璃化和干燥的情况下，可以利用更高浓度dmso的溶液，例如，30％。

卵巢、子宫和睾丸切片的冷冻

为了冷冻，将卵巢、子宫或睾丸组织切割为小尺寸，例如，1mm×10mm×10mm或更小尺寸，例如，比如1mm×3mm×1mm。然后将组织切片如以上关于卵母细胞所述(顺序浸没在逐渐增大的lyo溶液)暴露于存放缓冲介质中的由cp和糖类组成的lyo溶液，但暴露时间更长，例如5分钟、10分钟或更长。在暴露于lyo溶液之后，将切片放置在载体比如cryotop(日本kitazato)中或pctwo/2017/064715a1中所述的具有特殊荚(也称为胶囊)的吸管内并如以上关于卵母细胞所述进行冷却。

冷冻之后样品的初步干燥

干燥步骤在图12中示出并在图15的流程图中描绘。结合图12中的精子样品显示了干燥工艺，但该干燥工艺也与本文所述的其他生物样品一起使用。将表面上或小瓶中的细胞放置在与温度控制器6连接的装置7的搁板5上。金属冷却表面可以是装置7的一部分，然而，或者可选地，可以是在装置之外的冷却表面并然后连同样品一起放置在装置内。装置7可以是图1-10d中示出的装置类型。封闭装置7——其内部含有样品，以创建密闭的内部空间，并且打开经由管7a与密闭的内部空间连通的真空泵9以在密闭的内部空间创建真空以便降低压力。与密闭的内部空间连通的真空监测器10指示例如10毫托至100毫托的压力以便监测密闭的空间(在本文中也被称为密闭腔室)内的压力。装置7内的冷凝器11被设置为低于搁板温度的温度并且连接至冷却系统8，该冷却系统8可以是电力或其他主动冷却机构。可选地，为了冷却，如上所解释比如在图5的实施方式中，装置可以在液氮容器内以提供被动冷却。注意，真空泵9、真空监测器10、冷却系统8和温度控制器6被示意性地显示，因为可以利用常规泵、控制器和监测器以实现各自功能。

在相对高负温下干燥(称为初步干燥)通过保持搁板温度略低于所使用的lyo溶液的tg'(玻璃化转变温度)来完成，在一些实施方式中，该温度是-10℃、-30℃、-50℃或更低。在一些实施方式中，真空被设置为100毫托、80毫托、50毫托或者在一些实施方式中低至10毫托。在一些实施方式中，可以将冷凝器温度设置为低于搁板温度的温度(例如，在-100℃和-196℃之间)。

初步干燥之后的二次干燥

在完成初步干燥之后，二次干燥是任选的，并且通过以逐步方式增大搁板温度来完成，例如，每小时将搁板温度升高10℃直到达到所需的存储温度其可以是ln至rt。在初步和/或二次干燥工艺结束时，将小瓶(或装置)在真空下密封，或者可以将氮气插入在腔室内并用惰性气体密封。注意，在干燥期间将样品保持在玻璃转化温度下，因此不会发生熔融。注意，热电偶可以在温度升高时测量温度，并且可以使用控制器来控制这种温度升高。(注意，在玻璃化中，水不会在冰晶中移出)。

干燥之后的再水化工艺

图14中示出了再水化工艺。要再水化的冷冻样品可以是，例如在吸管中冷冻的卵母细胞或胚胎的样品，或冷冻成小球并存储在真空密封小瓶中的精子细胞的样品，或可以在吸管中或在载体中的组织切片，该载体被放置到小瓶中以便如上所述在冷冻干燥工艺中进行真空密封。首先，将含有卵母细胞或胚胎25的吸管26或具有含有精子或组织切片27的液滴的小瓶或载体28在氮蒸气下或以非常快速的方式(从存储它们的位置)取出并将吸管26/载体28浸入到容器29中的温热的溶液中。可以将吸管26或载体28浸入在具有例如1ml体积的温热溶液中。当要对载体上或小瓶内的小球进行再水化时，那么温热溶液优选地具有液滴的初始体积，例如，将在10μl的温热溶液中对10μl的小球/液滴进行再水化；如果要对超过1个液滴/小球进行再水化，那么应将体积加在一起(以合计小球/液滴的组合体积)。温热溶液可以是用于冷冻和干燥的lyo溶液中的一种。然后可以将细胞/组织移入50％的第一溶液的容器30中，从容器30去除并放置到25％的第一溶液的容器31中，然后去除并浸入洗涤溶液的容器33中，例如可以将精子在icsi培养基中稀释并且然后注射到卵母细胞中。(在洗涤溶液之前也可以利用含有不同百分比的第一溶液的另外的容器32)。

图15的流程图中显示了冷冻干燥和再水化样品的方法，其中将含有样品的载体顺序插入到逐步增大lyo溶液的一系列溶液中，然后将载体放置在液氮以便进行冷冻干燥，然后将载体去除并放置在其中降低密闭腔室的温度和压力并加热样品的装置中。然后将温度逐渐升高以进行二次干燥，然后将含有样品的小瓶密封。将样品顺序插入到一系列逐渐减小的lyo溶液，然后浸入洗涤溶液中。

材料和方法

实施例1

精子收集

从n＝3头sarda品种的公羊收集精子样品，并汇集在一起以作为单个样品分析。使用casa(ivos，hamiltonthorne，biosciences)评估浓度和运动性。该实验仅考虑了呈现85％或更高的运动性的精子。将精子样品在添加有含有0.25m海藻糖和0.4m山梨糖醇的lyoa溶液或含有0.16m海藻糖和0.26m山梨糖醇的lyob溶液的tris培养基和20％蛋黄中稀释至浓度5,000万个精子/ml。然后将精子以1℃/min冷却至4℃，然后使用casa重新评估运动性。

冷冻

在该实验中，通过将10μl的精子液滴移液在预冷却至各种温度(-10、-25或-35℃)的盖玻片上并保持1小时完成冷冻。然后将盖玻片去除并通过将其放置在温热的板(38℃)进行温热。

冷冻干燥

我们使用了新装置(被称为darya，由fertilesafe，nes-ziona，israel生产)。(注意，装置是本文结合图1-10d所述类型的装置，其减小了密闭腔室内的压力并降低了其温度)。它能够非常快速地将真空压力降低至10毫托。它包括具有1升容积的小金属圆筒，该小金属圆筒具有两个隔室(如图1中)：冷凝器放置在一个隔室中的ln2液位上，并且样品包含在另一个隔室中，其由加热器调节，并且连接至真空泵。我们将真空设置为80毫托并且根据实验组将样品加热器设置为各种温度。在冷冻(在每个温度下)5分钟之后，将冷冻样品放置在冻干机中。由于冷冻是在非常靠近darya冻干机的地方进行，该darya冻干机已经打开并准备接收样品，因此冷冻非常快速地进行(1-2秒)。在每个干燥周期中，将3-5个载玻片放置在darya装置中。

在1小时后，通过将盖玻片放置在温热的板(38℃)上几秒，样品解冻，因为解冻非常快速。

体积和重量测量

在干燥存放在-10℃(10分钟)和-25℃(1小时)的温度下的样品之前和之后，通过使用校准的移液管和高精度分析天平(sartoriused224s)测量体积的量和液滴的重量。

冷冻显微镜和低温sem

通过装配有冷冻载台bcs196的光学显微镜(linkam，waterfeeld，uk)进行冷冻显微镜分析。将5μl的精子在lyoa和lyob(溶液是相同组合物，但山梨糖醇的浓度不同)中冷却低至-10℃或-25℃并在这些温度下存放10或60分钟。(将其他样品在各种温度下在darya中冷冻干燥10分钟并放置在冷冻显微镜中。)

获取图像和视频记录，并根据以下公式计算未冷冻面积/总面积的比率：

％u＝(at-ac)/at*100

其中u是未冷冻的分数；at是总表面积；ac是晶体表面积。

使用装配有真空腔室的扫描电子显微镜(sem，zeiss，oberkochen，德国)进行更多的低温分析，这避免了冷凝并小心地将样品液滴与环境隔离。将lyob中的5μl精子放置在-10℃下的装置腔室中并存放在该温度和大气压下20分钟。同样地，在第二实验中应用相同的温度和时间条件，其不同仅在于压力设置(10帕斯卡＝75毫托)。

统计分析

使用学生t-检验分析各组之间精子运动性的差异。显著性设置为p＜0.05。数据表示为平均值±标准偏差。

结果

冷冻-解冻和部分冷冻干燥后的解冻后运动性

在精子收集和casa分析之后，我们发现，当将将精子暴露于lyoa溶液时，它们的运动性降低。运动性从86％降低至30％，但仅是暂时的。实际上，在2分钟之后，它上升至60％。在将精子缓慢冷却至4℃之后，运动性保持不变(61％)。暴露于lyob溶液的精子没有显示任何相关变化，并展现出67％的冷却后运动性。

在冷冻至不同的高零下温度，-10℃、-25℃和-35℃之后，暴露于lyoa的精液的解冻后运动性(ptm)分别是35％、36％和38％(表1)。

表1在使用两种不同溶液(lyoa和lyob)冷冻至不同温度后解冻后精子运动性

在冷冻并解冻至-10℃和-25℃之后暴露于lyob溶液的精液优于暴露于lyoa(64，5％，64％)，但在-35℃下显示出降低(31％)，如表1中所显示。

我们记录了当暴露并维持在高零下温度下持续1小时后，精液中发生的变化。

当将两种溶液中的冷冻精子维持在-10℃或-25℃的零下温度持续1小时后，ptm非常低(＜10％)。在-35℃时，没有运动性记录(表2)。

最后，在-10℃的温度下冷冻干燥1小时对精液不利，实际上，在两种溶液中的ptm均低于10％(表2)。

然而，当在lyoa溶液中在-25℃在10毫托下进行冷冻干燥时，ptm是35％，而在lyob溶液中，其略好，为46.6％(表2)。

表2解冻后精子运动性：(a)在使用两种不同溶液(lyoa和lyob)冷冻并在不同温度下存放1h之后以及(b)在使用两种不同溶液(lyoa和lyob)在两种不同温度下部分冷冻干燥(ped)之后

结果显示为平均值±sd。不同字母(a、b)指示行之间和列之间精子运动性的显著差异(p＜0.001)

在-35℃下未进行pfd。

在部分冷冻干燥之前和之后的体积和重量

在-10℃下用lyoa冷冻干燥之后的体积和重量减少如下：80μl的初始体积减少至76μl，并且初始为92mg的重量减少至86mg。

在-25℃下用lyoa冷冻干燥之后的体积和重量减少如下：80μl的初始体积减少至70μl，并且初始为92mg的重量减少至80mg。

在-10℃下用lyob冷冻干燥之后的体积和重量减少如下：80μl的初始体积减少至75μl，并且初始为92mg的重量减少至84mg。

在-25℃下用lyob冷冻干燥之后的体积和重量减少如下：80μl的初始体积减少至65μl，并且初始为92mg的重量减少至71mg。

低温冷冻显微镜

从存放在-10℃下持续10分钟的公羊精液样品收集的冷冻显微镜数据显示出，对于有或没有先前的冷冻干燥，在未冷冻分数(u)的量和冰晶尺寸方面存在明显的差异。与未冷冻干燥样品(19％，图18-b)相比，冷冻干燥后lyoa中的u比率(u＝28％，图18-d)几乎为两倍。

在lyob样品中显示了更明显的差异，其中与未冷冻干燥的样品(u＝13％，图18-a)相比，冷冻干燥溶液展现出非常大的u(30％，图18-c)。另外，发现，在冷冻干燥样品(图18-c，18-d)中的冰晶比未冷冻干燥的样品(图18-a，18-b)中的那些小得多。

低温扫描电子显微镜(sem)

与在大气压下冷却的样品中发现的大晶体(图19-a)相比，通过在真空压力(75毫托)下暴露于升华工艺样品并在-10℃下保持20分钟进行lyob的sem分析显示了更小的冰晶(图19-b)。

实施例2

名称：与冷冻精子相比，冷冻干燥的人精子在uv辐射后显示出高的dna完整性。

研究问题：a)冷冻人精子与b)冷冻/干燥(冻干的)人精子在uv辐射之后的dna完整性比较。

简要答案：与冷冻精子相比，冷冻干燥的人精子维持高的dna完整性。

已知的是：最近显示，在空间站中在干燥状态下保存9个月并暴露于宇宙辐射的小鼠精子仅显示轻微的dna损伤，这种损伤由卵母细胞修复并产生正常后代。

研究设计、大小、持续时间：收集人精子并冷冻并且冷冻干燥。使用hallosperm对于如下测量dna完整性：1.新鲜对照、2.冷冻干燥并再水化、3.冷冻干燥辐射并再水化、4.冷冻辐射并解冻。

参与者/材料、设置、方法：

将捐献用于研究的新鲜人精子样品(n＝3)首先稀释1:1(v/v)在冻干溶液(lyos：α-memeagle-0.25m蔗糖，0.25m海藻糖和α-memeagle培养基中的0.6％(w/v)has)中，然后通过直接浸没到无菌液态空气(clair，fertilesafe，以色列)进行冷冻保存。将冷冻干燥的小球保持在4℃的小瓶中并将冷冻小球保持在液氮下玻璃小瓶中。使用了四组：1.新鲜对照、2.冷冻干燥并再水化、3.冷冻干燥并在再水化前辐射、4.冷冻并在解冻前辐射。使用冷冻灭菌干燥装置(darya，fertilesafe，以色列)进行冷冻干燥。然后，将冷冻小球或干燥的小球使用uv辐射持续30分钟。使用(0.2ml温热至37℃的lyos)对干燥的精子进行再水化，并在温热(37℃)的显微镜载玻片上对冷冻小球进行解冻。使用hallosperm试剂盒对dna完整性进行评估。

主要结果和偶然作用：

新鲜人精子显示出85％的dna完整性(84/98)。再水化的人精子未显示出显著的细胞损失，并且dna完整性也没有降低。新鲜精子浓度为10·10⁶个细胞/ml并且运动性超过50％，dna完整性为81.06％±9.2％。解冻后运动性(未干燥)为新鲜的(归一化)相同样本的65-80％。在干燥和再水化之后，用lyos再水化的组的浓度为5.375·10⁶个细胞/ml。辐射的冷冻干燥的人精子显示出84％±8.1％的dna完整性和5·10⁶个细胞/ml的浓度。辐射的冷冻精子的dna完整性显著(p<0.05)更低并且仅9％±15％具有完整的dna，而浓度略微更低，为4.5·10⁶个细胞/ml。辐射的冷冻精子的形态观察显著不同于辐射的干燥的精子；在冷冻状态下辐射后，尾部和膜丢失，并且dna显示出更大的空心。图16显示了辐射的冷冻精子(左侧)和辐射的冷冻干燥的精子(右侧)的空心精子染色。

这些结果显示，由于干燥工艺和在干燥状态辐射，没有细胞损失，也没有对dna完整性的额外损坏。根据先前使用干燥的精子的动物研究，如果对dna没有损坏，那么精子可以用于受精，产生活的正常后代。人精子冷冻干燥是一项革命性的技术，这将允许在保护免受uv辐射的室温下长期存储精子。

限制性，谨慎的理由：

这项研究是在少量的样品上进行的，并且需要进行icsi后正常的胚胎发育的验证。

实施例3(使用卵巢组织)

将小鼠卵巢解剖并切成1×10×5mm。将卵巢切片暴露于pbs中含有10％dmso、10％has的lyo溶液。在暴露于lyo溶液之后，将切片放置在如pctwo/2017/064715a1中所述的具有特殊荚(也称为胶囊)的吸管内并使用darya装置以1℃/min的速率冷却。

图12和13a中示出了干燥步骤。将表面上或小瓶中的细胞放置在搁板上。真空监测器指示10毫托的压力并且冷凝器设置在-115℃的温度。通过保持搁板温度略低于-30℃的tg'进行相对高负温下的干燥，即初步干燥。通过每小时将搁板温度升高10℃直到达到所需的存储温度——其可以为ln至rt，进行使用darya的二次干燥。在初步和/或二次干燥工艺结束时，在真空下密封小瓶直到进行再水化。将组织在37℃温热的lyo溶液中进行再水化，然后固定在2％的甲醛中。

结果显示，在再水化并用苏木精-伊红染色后，我们没有发现新鲜对照与冷冻干燥的组织之间组织学上的任何不同(见图17)。

冷冻干燥干细胞的方法

以上讨论了用于冷冻干燥精子、卵母细胞胚胎、生殖组织等的方法。以上所述的冷冻干燥方法连同再水化工艺也可以用于根据本发明的干细胞。

干细胞是未分化的细胞，当在实验室中操作时，其可以根据干细胞起源分化成不同细胞类型。它们已在临床设置中应用许多年。造血干细胞已被用于治疗血液病和非血液病二者，而最近源自骨髓的间充质干细胞(msc)已成为再生医学领域的实验室和早期临床研究的课题。胚胎干细胞(esc)是多功能细胞，其能够形成稳定的细胞系，并保持分化为所有三个生殖层的能力。这使得它们在再生医学和毒理学中都具有特殊的重要性。诱导的多功能干细胞(ips)也可提供与胚胎干细胞类似的应用，而不会出现围绕它们的一些令人困惑的伦理问题。干细胞商业化和临床应用的一个基本先决条件是适合长期储存的冷冻保存方案。

当前，通过冷却细胞并将细胞存储在液氮或氮蒸气中来进行所有干细胞的冷冻保存。冷冻保存可以通过缓慢冷冻(其采用相对较低的冷冻保护剂浓度和缓慢的冷却速率)进行，其主要用于造血干细胞和间充质干细胞，或者可以主要通过使用高冷冻保护剂浓度和高冷却速率进行的玻璃化(固化样品而不产生冰晶的工艺)进行，其主要用于esc和ips。然而，这些保存方法价格昂贵。以上参考精子胚胎、卵母细胞、生殖组织讨论了这种保存方法的缺点，并且这些缺点完全适用于这些用于干细胞的方法。因而，将冷冻保存的干细胞维持存储在ln中具有较高的维护成本，需要专门的专用设施和训练有素的工作人员，运输麻烦且非常昂贵，需要有保障且连续的ln供应，并且存在储罐故障的风险。另外，存在由于被污染的样品而在样品之间传播病原体的风险。而且，ln的工业生产和分销以及专门的存储设施的能源需求都具有严重的环境影响，并留下大量的碳足迹。由于所有这些原因，根据本发明的干细胞的保存是极其有益的。

以上已讨论了冷冻干燥工艺，也被称为脱水生活或无水生活，为了简洁起见，在此不再重复。

以下描述的是通过冷冻干燥干细胞的干燥方法，干细胞包括但不限于造血干细胞、msc、esc和ips。将细胞浸入特殊的冷冻干燥溶液/多种溶液中，然后使用结合图1-10d和12-13所述类型的设备进行冷冻和干燥。再水化后的结果使得这些细胞能够在培养基中生长并维持其分化能力。

现在将描述根据本发明的成功冷冻干燥干细胞的整个方法。它包括用于这种目的的溶液和冷冻干燥装置。本发明提供了冷冻工艺、干燥工艺和再水化工艺。干细胞可以用于研究或用于临床应用和再生医学。

因此，本发明提供以上所述的用于冻干溶液/多种溶液(lyo溶液)的组合物，其基于糖类比如蔗糖、山梨糖醇、葡萄糖、葡聚糖和海藻糖以及冷冻保护剂(cp)比如二甲亚砜(dmso)、乙二醇(eg)、丙二醇(pg)以及大分子和蛋白质比如人血清白蛋白(hsa)、胎牛血清(fcs)、lea蛋白质以及抗氧化剂比如虾青素、表没食子儿茶素没食子酸酯(egcg)、抗坏血酸。lyo溶液可组合使用，即，dmso和hsa和缓冲溶液比如tcm199、pbs、rpmi-1640或hepestalp或本领域中任何其他已知溶液。

根据实验室规程收集通常在实验室培养基中生长的细胞，该规程取决于细胞的确切类型和随后的培养系统。然后评估生物材料的浓度，即，每1ml的细胞数。它们可以被染色或者可以不被染色以便评估生存力。因此，本发明提供了如下所述在lyo溶液中之后冷冻或玻璃化细胞的方法。

细胞的冷冻

图12和13a的装置用于根据本发明的干细胞。因而，可以通过返回参考图12来理解冷冻/玻璃化参数/工艺，如以上实施方式所述，该图显示了在装置7的预冷却的金属表面2上浸入在具有小体积1的lyo溶液中的细胞样品(初始，样品放置在装置外的冷却金属表面上或放置在已在装置中的冷却金属表面上)。可以通过移液管3或优选地导致小于200μl体积的任何其他方法来制造液滴。液滴可以在冷冻之前放置在小的表面比如玻璃或塑料表面上或可以直接冷冻在金属表面上并且可以在冷冻之后收集到维持在同一温度下的玻璃小瓶。冷却速率由表面温度和液滴的体积决定，例如，通过使用冷却在维持在高负温(-20℃至-50℃)下的表面上的小液滴(10-20μl)或通过使用冷却至-50℃和ln或液态气体温度之间的温度的较大的体积例如(20-200μl)来使用快速冷却速率。

应当注意，对于一些实施方式中的干细胞，利用了缓慢的冷冻速率。例如，以1-10℃/min从-7℃的接种温度至40℃，然后施加真空。

细胞的玻璃化

成功玻璃化取决于三个主要因素：样品的体积、样品的粘度和冷却速率。这三个参数根据下式相互作用：

玻璃化概率＝(粘度×冷却或升温速率)/体积

因此，样品的粘度和冷却速率越高以及体积越小，那么发生玻璃化的概率增大。

为了冻干，可以在将细胞放置在金属板上之期间对其进行玻璃化。

esc的玻璃化通常需要将esc菌落碎片逐步暴露于其共同组分是dmso和eg的两种增大冷冻保护剂浓度的玻璃化溶液。本文描述了可以使用这种方案的一个实例，并且应当领会，举例而言以非限制性方式描述了该方案。也就是说，可以利用玻璃化的替代方法。用于esc的玻璃化方案的实例如下：使用两种lyo溶液(ls)，二者均基于存放(holding)培养基，其包括补充有20％的胎牛血清(fbs)的含dmem的hepes缓冲液。第一种ls(ls1)由10％dmso和10％(eg)组成。第二种玻璃化溶液(ls2)包括20％dmso、20％eg和0.5m蔗糖。首先将4至6团块的es细胞在ls1中温育1分钟，接着在ls2中温育25秒。然后将样品在20μl液滴的ls2中洗涤和放置在vs2的1–2μl的液滴内。将团块装载到载体比如cryotop载体的端部。使用如以上所提及美国专利号9,890,995的clair装置可以将载体直接浸没到ln或浸没到无菌液态空气中。替代载体的使用可以是通过将具有ls1的细胞装载到如pctwo/2017/064715a1(12)中所述的具有特殊荚(也称为胶囊)的吸管内持续1分钟，然后使用吸水纸比如kimwipe去除过量溶液，然后将吸管插入到ls2持续25秒，接着吸收溶液并使用clair装置立即浸没到ln或无菌液态空气中。

在将吸管快速插入到由ln杜瓦瓶19产生的ln或无菌液态空气20之后，将它们放置在装置21中(见例如图13a)，其中搁板温度低于溶液的tg，例如-90℃(以避免去玻璃化损伤)，当放置到ln容器24中时，该搁板温度由加热器22和设置在较低温度的冷凝器23控制。

初步干燥

装置21中用于干细胞的干燥步骤与图12和13a相同。将表面上或小瓶中的细胞放置在连接至温度控制器6的搁板5上。将装置7关闭，并且真空泵9开始运行。真空监测器10指示例如10毫托至100毫托的压力。将冷凝器11设置在低于搁板温度的温度并连接至冷却系统8，其可以是主动冷却比如电冷却或可选地可以是被动冷却比如液氮的容器24。通过保持搁板温度略低于所使用的lyo溶液的tg'进行初步干燥，该lyo溶液的tg'可以是例如-10℃、-30℃、-50℃、-70℃、-90℃或更低。将真空设置至100毫托、80毫托、50毫托或低于10毫托。将冷凝器温度设置至低于搁板温度的温度(例如，在-100℃和-196℃之间)。

通过以逐步方式，例如，将搁板温度每小时增加1℃至10℃直到达到可为ln至室温(rt)的所需存储温度，(在完成初步干燥之后)使用装置7进行可选的二次干燥。在初步和/或二次干燥工艺/多个工艺结束之后，将小瓶(或装置)在真空下密封，或者可以将氮气插入腔室内并用惰性气体密封。

再水化工艺

以如上结合其他生物样品所述的图14(和图15的流程图)的方式进行干细胞的再水化。可以将待再水化的冷冻样品冷冻在吸管或载体中，并放置到小瓶中以便真空密封。首先，在氮蒸气下或以非常快速的方式将含有干细胞25的吸管(一个或多个)26或含有干细胞27的载体(一个或多个)28(从存储它们的地方)取出，并将吸管/载体浸入到容器29中的温热的溶液中。可以将吸管26浸入在具有1ml体积的温热的溶液中。当载体上或小瓶内的小球要再水化时，那么温热的溶液优选地具有样品的初始体积，例如，将10μl的小球/液滴在10μl的温热溶液中再水化，如果要使超过1个液滴/小球再水化，那么体积应当加在一起(以对应于所有液滴/小球的总体积)。温热的溶液可以是用于冷冻和干燥的lyo溶液的一种。然后可以将细胞移动到容器30中50％的第一溶液中，然后(以如上所述相同方式)移动到容器31中25％的第一溶液中，接着移动到容器32中的最终溶液中，例如，细胞可以在培养基中稀释，然后可以注入到患者中或继续在培养基中生长。

因而，可以领会，本文详细描述的用于冷冻干燥和再水化卵母细胞、胚胎和精子方法、装置和系统适用于冷冻干燥和再水化干细胞。

冷冻干燥源自人ubc的单核细胞–第二&第三实验

目的：这些实验的目的是为了使用(图10d的)fertilesafedarya装置冷冻干燥(冻干)源自人脐带血(ucb)的单核细胞(mnc)。在初步研究中，其中使用darya装置用4种不同溶液(基于pbs或rpmi的imt-2和imt-3)对mnc进行冻干，使用imt-2(rpmi)溶液达到了最佳结果。这些结果是基于细胞计数和台盼蓝染料。

在以下实验中，我们希望使用活的/死的荧光染色(fitc/pi)来更好地评估细胞的存活率，这种方法在确定生存力以及使用annexinv-fitc和pi荧光染色来评估凋亡细胞百分比方面具有更高的准确性。两种测定(生存力和凋亡)均使用荧光活化细胞分选(facs)装置进行评估。

在这些实验中，使用imt-2(rpmi)溶液将mnc冻干，然后将样品存储在-80℃下或者存储在干燥的托运装置并递送至jerusalem的外部实验室hadassa医疗中心以便进行facs评估。

实验描述：

2018年8月6日在sheba医疗中心在0345收集的ucb于同一天被fertilesafe的实验室接收(实验2)。2018年8月8日在sheba医疗中心在2100收集的另一个ucb单元于第二天(2018年8月9日)被fertilesafe的实验室接收(实验3)。所有单元从收集直到它们被处理均被保持在室温(rt)下。

通过将3ml的ficoll放置在15ml试管中并在其上放置3ml的ucb以ficollhistopaque-1077梯度分离血液。以1000g不间断地离心30分钟。

然后取出mnc层并放置在另一个15ml试管中。将3个mnc层收集到一个15ml试管并添加大约8ml的pbs(不含钙和镁)。以相同方式完成总共4个试管。将试管在300g下离心另外10分钟。去除上清液并添加另外10ml的pbs(不含ca和mg)，吸出细胞并以300g再次旋转10分钟。然后，去除上清液，并且将每个小球重新悬浮于imt-2(rpmi)溶液中，其由rpmi中的0.945mg/mlegcg、0.1m海藻糖组成。

从第二实验，对每个含有0.5ml的细胞悬浮液的2个小瓶进行冷冻干燥，并且在第三实验，对每个具有0.5ml细胞悬浮液的4个小瓶进行冷冻干燥。

通过将样品放置在-20℃冰箱中的金属块中持续大约15分钟进行冷冻，当样品达到-2.5℃时，使用放置在ln中的预冷却的针进行接种。在将样品冷冻(表示为达到-10℃--15℃)后，将它们转移到darya装置，其搁板温度为-35℃，其真空压力为200毫托，且冷凝器处于-100℃持续72小时。在72小时后的第三实验中，将细胞保留在处于-69℃的搁板温度下的darya装置中持续另外的24小时。

在72小时(实验2)之后，打开darya装置，将小瓶真空密封，将2个小瓶放置在-80℃下持续4天，然后将它们放在干燥的托运装置(～-155℃)递送至jerusalem的实验室。在darya装置中96小时后(实验3)，去除小瓶并进行如下处理：将2个小瓶真空密封并放置在干燥的托运装置中，用450μl加热至37℃的蒸馏水将1个小瓶再水化。取出样品以便进行台盼蓝(trypanblue)染色并进行细胞计数评估，将剩余的保留在密封的小瓶中并放置在冰中。将最后的小瓶进行真空密封并放置在冰中。

将所有6个样品带至jerusalem。通过将温热至37℃的450μl的蒸馏水添加至每个小瓶，对仍然干燥的5个小瓶进行再水化。对所有6个小瓶进行facs评估，对于生存力，使用碘化丙锭(pi)作为死细胞的标志物，对于凋亡，使用膜受损细胞的annexinv-fitc缀合的标志物(附着在暴露的磷脂酰丝氨酸位点上)和pi标记死亡细胞。

使用血细胞计数板对细胞浓度进行计数，并用台盼蓝染色以确定再水化之前和之后的生存力。

如下计算细胞生存力＝(活细胞/总细胞)x100

再水化后活细胞计算如下

＝(再水化后活细胞/冻干前活细胞)x100

结果：

表1：两个实验中冷冻干燥的小瓶列表以及在jerusalem处评估前它们如何被处理

表2:显示实验2&实验3的新鲜样品和实验3的再水化的样品1的细胞浓度和细胞生存力

表3.根据荧光染色(pi/fitc)描绘生存力百分比，其中pi指示死亡细胞

讨论：

在以上实验中，我们看到，根据facs，样品之间的生存力范围为活细胞的～55％至～82％。使用tb在fertilesafe染色的样品(样品#1)显示出81％生存力，而facs结果显示～64％。这种差异主要由于tb染色引起的假阳性特征，而pi是仅进入损伤细胞的细胞核的荧光标记，其具有高得多的准确性。

尽管如此，它显示出，在冷冻干燥后大多数细胞可存活。在实验(实验2和实验3)之间可看到结果的主要差异。实验2在两个样品(样品#4&5)中均产生了(根据facs结果)大约82％的类似且较高的生存力，而在实验2中，生存力在55.7％至67％之间。我们认为，再水化后生存力的这些差异是由于所收到的新鲜单元的差异所导致。我们在先前的工作中已看到，虽然新鲜细胞都是活的，但随着收集时间和冷冻干燥时间之间的时间流逝，它们会变质。在第三个实验中，递送后第二天就收到了ucb单元，并且我们还发现分离后的细胞数较低；与每毫升220万个细胞(实验2)——这是在我们先前工作中在分离方案后收到的更多的细胞数——相比，每毫升7.13万个细胞(实验3)。

此外，关于annexinvfacs数据，由于这是在没有新鲜对照的情况下进行，我们不能解释该结果。当观察facs图像时，我们不知道哪个比例的细胞是凋亡的，哪个比例的细胞是活的。坏死细胞的数量已经很清楚了，但是缺乏对照，我们无法做出任何推断，甚至无法知道为facs选择的“门”是否是正确的“门”。

如果这些工作继续，新鲜单元必须进行评估，以便更好地理解并评估再水化后的结果。

对于已完成的存储评估，我们可以看到，在-80℃下存储4天并在干燥托运装置中转移不会损坏样品，如实验2的样品4&5的高生存力(82％)所显示。

在第三个实验中，我们发现，在我们实验室再水化并在4℃下转移的样品(#1)的生存力为63.9％，其与在干燥状态下存储并在干燥托运装置中转移的样品(#3&6)的生存力(分别为55.7％和67％)类似。在4℃下干燥转移的样品#2再水化之后具有55％的生存力。在该实验中，没有发现转移或存储条件损坏了细胞。如上所述，我们认为，这些实验中较低的生存力是由于ucb单元接收它们所经历的过程之间的差异所造成的。

冷冻干燥激活的干细胞的报告

通过白血球分离术(leukapheresis)(根据irb)收集来自shiba医院的细胞，在2ml中发现600m细胞。将细胞用冷冻溶液稀释至10m/ml的浓度或稀释到2种不同的冷冻干燥溶液中。在两个阶段(f1和f2)中，用rpmi培养基(对照)中10％dmso进行冷冻。根据上述方法进行冷冻和干燥的所有程序。

测试了两种冷冻干燥溶液，dry2是rpmi培养基中0.1m海藻糖和1mg/mlegcg，而ddmso是rpmi培养基中5％dmso和10％has。

结果显示，在培养72h之后，ddmso生存力与培养1周后的细胞数和活细胞均相同，但菌落(cfu)数较少。

此外，在培养一周后，dry2呈现出cd3-cd8和cd3-cd4

1周之后

虽然已经针对实施方式描述了本发明的优选设备和方法，但本领域技术人员将容易领会，可以对其进行改变和更改，而不脱离所附权利要求所限定的本发明的精神和范围。