一种大西洋鲑三倍体连续批量诱导的方法与流程

本发明涉及染色体操作技术，具体地说是一种大西洋鲑三倍体连续批量诱导的方法。

背景技术：

大西洋鲑(salmosalar)，属鲑形目(salmoniformes)、鲑科(salmonidae)，俗称“三文鱼”，品质较高，属于高档食用鱼类，已经成为世界海水养殖产量最高的鱼类。随着近年来我国陆基工厂化循环水、深水网箱、养殖工船等模式的开展，以及持续增加的市场需求，大西洋鲑养殖业逐渐兴起。自然条件下大西洋鲑一般三龄性成熟，性成熟过程中，大部分能量用于性腺发育，导致其生长减缓、肉质急剧下降，从而影响其营养和经济价值。在人工养殖过程中，往往会出现性早熟的现象，给养殖业者造成很大困扰。同时，自然海域养殖难以避免发生鱼类逃逸，逃逸的鱼类会导致本地群体品种混杂和退化，造成基因污染，还会对生态环境造成影响。三倍体鱼因体细胞中含有三个染色体组，通常性腺发育异常，造成不育或低育，可避免性早熟。国外研究表明三倍体大西洋鲑的性腺发育的确会受到抑制，因而三倍体大西洋鲑诱导和养殖对于其绿色可持续养殖具有重要意义。

人工诱导三倍体在多种鱼类中均获得成功，有的鱼种三倍体已经用于商业化养殖。大西洋鲑三倍体人工诱导在国内尚未见到。在国外上世纪80年代就已有报道，发现压力休克法可稳定获得高诱导率的三倍体，但其诱导参数仅限于处理压力和处理时间的几个水平的摸索，成活率也较低，故大西洋鲑三倍体最适诱导参数或参数范围尚需完善。同时压力休克法受限于压力腔体积，一次处理受精卵卵量有限，而加大压力腔体积或是增加压力机数量都会大大增加成本以及操作难度，不现实。若要进行规模化生产，则只能通过分批授精分批诱导的方式进行，操作繁琐且无法保障受精卵的质量，故诱导效果的稳定性较差。往往使得同一批受精卵很多不能进行处理，无法诱导获得更多的三倍体，造成很大的浪费和损失。迄今为止，国内外均未见到同批鱼卵分组连续多次处理的相关技术报道。此外，大西洋鲑孵化时间长，孵化需60d以上，已有报道多是对孵化后鱼苗进行倍性鉴定，需要较长时间才能评价三倍体诱导效果，给其后续生产管理带来不便。本发明针对这些产业需求和技术问题，提供一种健康安全可持续生产的大西洋鲑三倍体诱导方法，不仅首次在不影响诱导率和成活率情况下使得同批三倍体诱导的受精卵量提高2-3倍，也可以使得三倍体诱导效果在发眼卵期就能明确，因而对于大西洋鲑三倍体诱导和养殖有其重要价值。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种大西洋鲑三倍体连续批量诱导的方法。

为实现上述目的，本发明采用技术方案为：

一种大西洋鲑三倍体连续批量诱导的方法，收集大西洋鲑精卵进行人工授精，将受精卵分成2-3组，依次连续对每组进行静水压诱导处理，抑制其第二极体排放，从而获得大西洋鲑三倍体；所述静水压诱导为，在受精后300-400度分(温度℃×时间min)，对第1组受精卵进行静水压处理，获得三倍体大西洋鲑；第1组受精卵诱导结束取出后，立即将第2组受精卵按照上述过程进行静水压诱导，如此可以连续诱导处理同批受精卵。

进一步的说：

1)精卵采集及孵育

采集大西洋鲑精、卵，按精卵体积比1:100比例人工授精，受精后2-3min，用清水多次洗卵，去除未受精卵和血块，分组，而后流水孵育；

2)静水压连续诱导

诱导加倍的处理时刻为受精后300-400度分，静水压处理压力为66-70mpa，处理时间为4-5min。每组静水压处理后按1-2mpa/s的速率缓慢降压至0mpa取出，之后加入同批的下一组受精卵，并重复上述过程，由此可以对同批受精卵进行静水压连续诱导处理，诱导后受精卵通过流水孵育获得三倍体大西洋鲑鱼苗。

所述步骤1)中人工授精、步骤2)诱导及孵育的水温均为7-10℃。

所述步骤2)中，静水压处理前1min将受精卵装入有7-10℃清水的容器中，并放入加压腔内，到处理时刻时进行处理；每组受精卵处理结束缓慢降压时，将下一组受精卵装入有7-10℃清水的容器中，受精卵取出后，迅速将下一组受精卵放入加压腔内进行处理；在300-400度分时间范围内，按上述步骤静水压连续诱导处理同批次分组的受精卵。

所述步骤2)中，静水压处理在15s内迅速加压到66-70mpa。

所述获得三倍体大西洋鲑在250度日发眼时，将发眼卵用70％乙醇在-20℃固定4h，剥掉卵膜、去除卵黄后，将胚体经蒸馏水冲洗后用流式细胞仪检测倍性。

本发明的优点和积极效果如下：

1、处理时刻是静水压处理最先需要确定的参数，本发明采用积温的方式评估大西洋鲑受精卵发育阶段，以度分为单位确定处理时刻。本发明水温不需精确控制，保持在一个范围内即可，更加便于生产应用。由于不同鱼种的鱼卵及受精生物学特征都不同，三倍体诱导参数在不同鱼种中差异很大，无法直接参考。本发明首先经大量单因子实验确定的最适参数范围，进而再对各参数范围通过综合分析，确定了大西洋鲑三倍体诱导的较适处理参数范围为受精后300-400度分，在66-70mpa静水压下进行诱导处理4-5min。实验发现，本发明确定的处理参数范围内三倍体诱导率可以保证在100％，成活率并无明显变化。

2、目前人工诱导鱼类三倍体已有研究报道均为在确定的处理时刻、处理强度和处理时间下进行单批次的诱导。大西洋鲑雌鱼为一次产卵，生产中一般通过解剖将所有成熟卵子取出；雄鱼精液通过麻醉后挤压腹部的方式采集，由于长时间麻醉易致死，一般也一次将所有精液挤出。其卵子挤出长时间放置易吸水硬化，精液也极易遇水激活，所以同批卵一般同时授精以保证其受精率。已有的研究与应用，一般为一批受精卵只进行一次诱导，而静水压处理效率受限于压力腔体积，若一批受精卵无法一次进行处理，则剩余受精卵只能作为二倍体进行培育，造成很大的浪费和损失。本发明首先确定大西洋鲑三倍体处理时刻在一定范围内均可达到较好的诱导效果，并通过多次实验证明，使用较高的处理压力可在不影响三倍体率及成活率的前提下缩短处理时间。基于以上特点，针对静水压诱导三倍体处理效率低的问题，提出了将同一批次受精卵分为2-3组，在最优处理时刻范围内连续进行较短时间的处理，并将升、降压的操作步骤进行统筹优化的高效诱导技术方案。经生产实践，在300-400度分的最优处理时刻范围内，对同批受精卵连续进行2组甚至3组的诱导，利用一台静水压机，可将诱导受精卵量提高至原来的2到3倍，大大提高了诱导效率。

3、大西洋鲑胚胎发育时期较长，尽早鉴定其三倍体率可以尽快确定诱导效果，也为后续诱导提供可靠依据。以往研究中通常是在孵化后进行倍性鉴定，往往需要60d以上的孵育。本发明通过70％乙醇低温固定的方式，将剥离的胚体进行流式细胞仪检测，在胚体期便可快速鉴定其倍性率。经过测试，将倍性鉴定时期确定为在250度日发眼时，在30d左右便可评价诱导效果，经反复比较发现此时期三倍体率与孵化后鱼苗的基本一致。本发明操作简便高效，可以为三倍体大西洋鲑规模化制种提供基础。

附图说明

图1为本发明实施例提供的大西洋鲑三倍体早期发育情况，其中a为13dpf，18dpf，40dpf；b为54dpf，60dpf。

图2为本发明实施例中第二组大西洋鲑三倍体流式细胞仪倍性检测情况；其中，a为二倍体对照组；b为三倍体诱导组。

具体实施方式

以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。

本发明方法适用性广，其可高效连续批量的诱导大西洋鲑三倍体，本发明方法于大西洋鲑受精卵的一定时刻范围内对其诱导处理，且处理时间较短，均可获得高诱导率和成活率三倍体，提高了现有的压力休克法的处理效率，从而为三倍体大西洋鲑的制种及其健康安全可持续生产提供了技术基础。

实施例1

1)精卵采集及孵育

采集大西洋鲑精卵，按精卵体积比1:100比例人工授精，受精后2min，用清水多次洗卵，去除未受精卵和血块，将其分为4组，流水孵育。人工授精及孵育水温为8.0℃。

2)静水压连续诱导

受精后310度分，提前1min将第1组受精卵装入有8.0℃清水的容器中，置于加压腔内，在15s内迅速加压到70mpa进行静水压休克处理，处理4min后，按1mpa/s的速率缓慢降压至0mpa；同时将第2组受精卵装入有8.0℃清水的压力容器中。

第1组受精卵降压结束后取出，置于水温为8.0℃的流水进行孵育；立即将第2组受精卵放入加压腔，在15s内迅速加压到70mpa进行静水压休克处理，此时约为350度分，处理4min后，按1mpa/s的速率缓慢降压至0mpa；同时将第3组受精卵装入有8.0℃清水的容器中。

第2组受精卵降压结束后取出，置于水温为8.0℃的流水进行孵育；立即将第3组受精卵放入加压腔，在15s内迅速加压到70mpa进行静水压休克处理，此时约为390度分，处理4min后，按1mpa/s的速率缓慢降压至0mpa，降压结束后取出，置于水温为8.0℃的流水进行孵育。

同时以第4组未经染色体诱导加倍的受精卵为对照，也置于水温为8.0℃的流水进行孵育。

3)受精卵的倍性鉴定

上述各组受精卵避光孵育，孵育水温为8.0-9.5℃，约500度日破膜孵化，获得三倍体大西洋鲑鱼苗(图1a和图1b)。每组在250度日发眼后，将发眼卵用70％乙醇-20℃固定4h，剥掉卵膜、去除卵黄，将胚体经蒸馏水冲洗后，用流式细胞仪检测倍性。以对照组的二倍体大西洋鲑为对照，dna含量为对照的1.5倍左右的胚胎为三倍体。经检测其三倍体率均为100％(图2)，20dph(孵化后第20天)鱼苗相对成活率分别为第一组95％、第二组90％、第三组92％。

由图1可见大西洋鲑三倍体组胚胎发育正常；图2a和b可见其为第二组大西洋鲑三倍体流式细胞仪倍性检测情况，第二组三倍体处理组鱼苗细胞dna相对含量是二倍体对照组的1.5倍，经鉴定为三倍体。

实施例2

1)精卵采集及孵育

采集大西洋鲑精卵，按精卵体积比1:100比例人工授精，受精后2min，用清水多次洗卵，去除未受精卵和血块，将其分为4组，流水孵育。人工授精及孵育水温为7.0℃。

2)静水压连续诱导

受精后305度分，提前1min将第1组受精卵装入有7.0℃清水的容器中，置于加压腔内，在15s内迅速加压到68mpa进行静水压休克处理，处理4.5min后，按1.5mpa/s的速率缓慢降压至0mpa；同时将第2组受精卵装入有7.0℃清水的容器中。

第1组受精卵降压结束后取出，置于水温为7.0℃的流水中孵育；立即将第2组受精卵放入加压腔，在15s内迅速加压到68mpa进行静水压休克处理，此时约为350度分，处理4.5min后按1.5mpa/s的速率缓慢降压至0mpa；同时将第3组受精卵装入有7.0℃清水的容器中。

第2组受精卵降压结束后，置于水温为7.0℃的流水中孵育；立即将第3组受精卵放入加压腔，在15s内迅速加压到68mpa进行静水压休克处理，此时约为400度分，处理4.5min后按1.5mpa/s的速率缓慢降压至0mpa，降压结束后取出，置于水温为7.0℃的流水中孵育。

同时以第4组未经染色体诱导加倍的受精卵为对照，置于水温为7.0℃的流水中孵育。

3)受精卵的倍性鉴定

上述各组受精卵避光孵育，孵育水温为7.0-9.0℃，约500度日破膜孵化，获得三倍体大西洋鲑鱼苗。每组在250度日发眼后，将发眼卵用70％乙醇-20℃固定4h，剥掉卵膜后、去除卵黄，将胚体经蒸馏水冲洗后用流式细胞仪检测倍性。以对照组的二倍体大西洋鲑为对照，dna含量为对照的1.5倍左右的胚胎为三倍体。经检测其三倍体率均为100％，20dph鱼苗相对成活率分别为第一组94％、第二组94％、第三组90％。

实施例3

1)精卵采集及孵育

采集大西洋鲑精卵，按精卵体积比1:100比例人工授精，受精后3min，用清水多次洗卵，去除未受精卵和血块，将其分为3组，流水孵育。人工授精及孵育水温为9.0℃。

2)静水压连续诱导

受精后310度分，提前1min将第1组受精卵装入有9.0℃清水的容器中，置于加压腔内，在15s内迅速加压到66mpa进行静水压休克处理，处理5min后，按2mpa/s的速率缓慢降压至0mpa；同时将第二组受精卵装入有9.0℃清水的容器中。

第1组受精卵降压结束后取出，置于水温为9.0℃的流水中孵育；立即将第2组受精卵放入加压腔，在15s内迅速加压到66mpa进行静水压休克处理，此时约为370度分，处理5min后，按2mpa/s的速率缓慢降压至0mpa，降压结束后取出，置于水温为9.0℃的流水中孵育。

同时以第3组未经染色体诱导加倍的受精卵为对照，置于水温为9.0℃流水中孵育。

3)受精卵的倍性鉴定

上述各组受精卵避光孵育，孵育水温为9.0-10.0℃，约500度日破膜孵化，获得三倍体大西洋鲑鱼苗。每组在250度日发眼后，将发眼卵用70％乙醇-20℃固定4h，剥掉卵膜、去除卵黄，将胚体经蒸馏水冲洗后用流式细胞仪检测倍性，以对照组的二倍体大西洋鲑为对照，dna含量为对照的1.5倍左右的胚胎为三倍体。经检测其三倍体率均为100％，20dph鱼苗相对成活率分别为第一组90％、第二组93％)。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护。