一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法与流程

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法。

背景技术：

脐带血造血干细胞可以用于造血干细胞移植，治疗血液系统和免疫系统等诸多疾病，有着重要的临床应用价值。脐带血造血干细胞大多以液氮冻存的形式存在于脐带血库中，在临床应用时再进行解冻复苏。脐带血造血干细胞解冻后的细胞活性和增殖能力保持，与脐带血的冻存过程密切相关。常规的脐带血冻存过程见图1。

程控降温是冻存过程的核心，通过程控降温，脐带血按照1℃/分钟的降温速率，由0℃以上逐渐降至零下80℃以下的超低温，然后放入液氮长期储存。1℃/分钟是最适合造血干细胞的降温速率，只有保证每份脐带血都尽可能的按照该速率冷冻，才可获得最好的冻存质量和解冻后活力。

现有程控降温技术存在以下几个问题：

1）对于添加冷冻保护剂前的脐带血标本温度缺乏控制；对于冷冻保护剂的添加过程缺乏控制；对于脐带血标本和冷冻保护剂（主要是dmso）的接触时长缺乏控制；对于最佳的程控降温起始温度缺乏认识。

2）控制相变回温的关键控制点设置不够合理。首先是大幅降温起始的样本温度设置偏高，和实际的样本相变温度差距过大，导致脐带血样本在相变前温度下降明显；其次是大幅降温速率偏小，脐带血样本暴露于超低温中时间过长，导致脐带血样本在相变后降温速率偏大。

3）在脐带血标本降温至稳定的-50℃之前，不能始终保持对于造血干细胞最优的1℃/分钟的降温速率，特别是在相变过程中和相变后阶段。

4）批量冷冻时，无法通过监测每一份脐带血的样本温度来进行程控降温，导致不同脐带血间的冻存质量差异较大。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，本发明的目的在于提供一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，最大程度的避免了脐带血细胞的损伤，并大大提高了脐带血造血干/祖细胞的回收率和细胞活率，更好的保持了脐带血造血干/祖细胞解冻后的增殖能力。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，包括以下步骤：

s1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；

s2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷至少10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到步骤1）得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；

s3，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：

s31，箱体温度3℃，等待3分钟；

s32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；

s33，箱体温度-50℃/分钟至箱体温度-50℃；

s34，箱体温度15℃/分钟至箱体温度-25℃；

s35，箱体温度-25℃等待3分钟；

s36，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-50℃或箱体温度-60℃；

s37，箱体温度-10℃/分钟至样本温度-90℃或箱体温度-120℃；

s38，结束；

s4，经上述程控降温后的脐带血标本放入液氮中进行长期储存。

进一步的，所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和右旋糖苷40的混合物，且冷冻保护剂添加体积为脐带血标本体积的1/4。

进一步的，所述冷冻保护剂中二甲基亚砜的体积浓度为50%，右旋糖苷40的质量浓度为5%。

本发明相比现有技术的有益效果为：

1、本发明所述的方法相比现有技术，优化了冷冻前准备工作：包括冷冻保护剂的添加和冷冻前的设备准备。具体来说，和现有技术相比，本发明增加了添加冷冻保护剂前的预冷过程，即脐带血标本和冷冻保护剂均先放置4℃冰箱预冷10分钟，避免了冷冻保护剂对细胞的损伤。并且本发明对冷冻保护剂的添加过程进行严格控制，一是使用微量注射泵，保证缓慢匀速添加，控制时长在10-15分钟，二是添加过程保证0-4℃低温环境，并边加边使用摇床混匀。这样可以有效缓解冷冻保护剂稀释过程中的散热，并保证冷冻保护剂和细胞的充分接触和渗透，在避免冷冻保护剂毒性的同时，又最大程度的发挥其冷冻保护的作用。

2、和公示技术相比，本发明的程控降温起始温度是3℃，而不是4℃。研究发现当程控降温起始温度小于3.5℃时，可更好的保持解冻后脐带血造血干/祖细胞的增殖能力；

3、本发明所述的方法对脐带血标本在由液态冷冻为固态时的散热和温度回升进行更为精准的主动干预和控制，并可以同时兼顾个体化冷冻和批量冷冻。

4、本发明所述的方法可以有效保证脐带血标本在达到稳定的-50℃之前始终保持1℃/分钟的降温速率，最大限度的保持脐带血造血干/祖细胞的活性和增殖能力。

附图说明

图1为常规的脐带血冻存过程示意图；

图2为冷冻前dmso暴露时长对脐带血解冻后cd34+细胞活性的影响（n=605）结果图；

图3为程控降温起始温度对脐带血解冻后cfu回收率的影响（n=1119）结果图；

图4为不同降温速率对脐带血解冻后cfu回收率的影响（n=4）结果图；

图5为大幅降温起始箱体温度对解冻后cd34+细胞回收率的影响（n=1119）结果图；

图6为使用样本温度监测运行的脐带血程控降温曲线；

图7为使用箱体温度监测运行的脐带血程控降温曲线；

图8为分别通过箱体温度和样本温度监测批量进行脐带血程控降温（n=5）脐带血造血干细胞解冻后cfu回收率对比图。

具体实施方式

实施例1

本实施例提供了一种优化的脐带血造血干细胞程控降温方法，包括以下步骤：

s1，采集后的脐带血在24小时内进行制备分离，去除红细胞和血浆，保留富含造血干细胞的有核细胞成分，为脐带血标本；同时，选择和要冻存的脐带血具有近似的有核细胞数和红细胞压积的废弃脐带血，按照和所述脐带血标本一样的方法进行制备和加入冷冻保护剂，作为后续程控降温时的参照标本；

s2，将所述脐带血标本和冷冻保护剂均置于4℃下预冷10分钟，再使用微量注射泵将冷冻保护剂加入到步骤1）得到的脐带血标本中，添加过程中脐带血标本置于0-4℃的低温环境下，添加时长控制在10-15分钟，边加边使用摇床混匀；添加了冷冻保护剂的脐带血标本需0-4℃保存，在20分钟内进行程控降温冷冻处理；

s3，将上述参照标本放入程控降温仪，将样本探针插入参照标本，用于标本温度监测，将程控降温仪箱体提前预冷至3℃，将添加了冷冻保护剂的脐带血标本放入金属保护盒中，然后再放入程控降温仪，开始程控降温，程控降温的程序设置如下：

s31，箱体温度3℃，等待3分钟；

s32，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-7℃或箱体温度-11℃；

s33，箱体温度-50℃/分钟至箱体温度-50℃；

s34，箱体温度15℃/分钟至箱体温度-25℃；

s35，箱体温度-25℃等待3分钟；

s36，箱体温度-1℃/分钟至样本温度-50℃或箱体温度-60℃；

s37，箱体温度-10℃/分钟至样本温度-90℃或箱体温度-120℃；

s38，结束；

s4，经上述程控降温后的脐带血标本放入液氮中进行长期储存。

实施例2

本实施例是上述实施例1的改进，是上述实施例关于冷冻保护剂的细化，本实施例中所述冷冻保护剂为二甲基亚砜和右旋糖苷40的混合物，且冷冻保护剂添加体积为脐带血标本体积的1/4；所述冷冻保护剂中含50%（v/v）二甲基亚砜（dmso）和5%（w/v）右旋糖苷40。

由于dmso在常温下对细胞是有毒性的，提前将脐带血标本和冷冻保护剂均先放置4℃冰箱预冷10分钟，可保证冷冻保护剂和脐带血标本在接触时均处于低温状态，避免dmso对细胞的损伤。

对冷冻保护剂的添加过程进行严格控制，一是使用微量注射泵，保证缓慢匀速添加，控制时长在10-15分钟，二是添加过程保证0-4℃低温环境，并边加边使用摇床混匀。这样可以有效缓解dmso稀释过程中的散热，并保证冷冻保护剂和细胞的充分接触和渗透，在避免dmso毒性的同时，又最大程度的发挥其冷冻保护的作用。

所述方法中增加了对dmso暴露时长的控制，即添加完冷冻保护剂的脐带血标本如不能立即进行程控降温冷冻，则放置4℃冰箱暂存，时间不宜超过20分钟。该时长的控制标准来源于605份脐带血解冻后的检测结果（参见图2），当dmso暴露时长小于35分钟时可更好的保持解冻后的cd34+细胞（造血干细胞）活性，再去除添加冷冻保护剂的15分钟，则从加完保护剂到程控降温的间隔应控制在20分钟以内。

所述方法中程控降温起始温度是3℃，而不是4℃。这来自于发明人对1119份脐带血解冻后的检测结果分析（参见图3），当程控降温起始温度小于3.5℃时，可更好的保持解冻后脐带血造血干/祖细胞的增殖能力。

所述方法中大幅度降温开始于样本温度降至-7℃时，而不是现有技术中普遍采用的-5℃或-6℃。这是通过实测数据而模拟出来的回归方程：t=-0.1123n-7.0817（t为相变温度，n为有核细胞浓度），即在现有冷冻保护剂条件下，脐带血样本的相变温度和脐带血的有核细胞浓度有关，有核细胞浓度越高，样本相变温度越低。在有核细胞浓度为0时，相变温度即为-7℃。本发明选择-7℃，一方面可以较-5℃或-6℃更为接近真实的样本相变温度，同时又能保证所有的脐带血不会在大幅度降温开始前发生相变。

所述方法中控制相变回温所设置的大幅度降温速率为-50℃/分钟，而不是现有技术中的-21℃/分钟，是因为我们发现更大幅度的降温可以诱使脐带血样本更快的发生相变，使得脐带血样本平均在-9℃左右即可开始相变，而此时箱体温度基本上正好处于最低点，可以更有效的抵消样本散热和减少样本回温。同时，同样是箱体温度降至-50℃，-50℃/分钟的降温只需要1分钟，随后箱体即快速回温（15℃/分钟，是当前程控降温仪的最大升温速率），这样可以缩短脐带血样本暴露于过低温环境中的时间，避免样本在相变后出现降温速度过快的情况。随后，当箱体温度由-50℃升至-25℃，本发明又设置了一个3分钟的平台期，同样是为了防止样本温度下降过快。经过以上这些条件设置，最终脐带血样本在相变过程中的温度变化可控制在2℃左右，明显优于现有技术的5℃，从而使得脐带血样本更加平稳安全的通过相变期。

在脐带血样本相变之后，本发明设置的降温速率依然是-1℃/分钟，而非-2℃/分钟，是因为经试验测定数据显示，-1℃/分钟的降温速率可以获得更高的cfu回收率（参见图4）。同一份脐血一分为二，分别使用-1℃/分钟和-2℃/分钟的降温速率进行程控降温，解冻后检测发现，虽然二者的有核细胞活性和cd34+细胞活性未见显著差异，但-1℃/分钟组的解冻后cfu回收率明显高于-2℃/分钟组。

本发明采用的评价指标主要为解冻后的cfu回收率，其反应的是具有增殖能力的造血干/祖细胞数量，和细胞活性、细胞回收率相比，cfu回收率更为敏感，也更为真实的反应脐带血的冻存质量。

本发明所述的方法可以同时兼顾个体化冷冻和批量冷冻。一台程控降温仪一次冷冻一份脐带血，通过对该份脐带血的样本温度进行监测来进行程控降温，这属于个体化冷冻。而在批量化生产时，我们需要使用一台程控降温仪同时冷冻多份脐带血，如果要通过监测样本温度来进行程控降温，就只能选择一份脐带血样本作为代表。但每份脐带血都存在差异，特别是不同的细胞浓度会直接影响到样本的相变温度，这就会导致同批次程控降温的脐带血的冻存质量参差不齐。针对这种批量冷冻的需求，本发明放弃使用样本温度，直接用箱体温度来设计和运行程控降温程序。即大幅度降温的起始点由样本温度降至-7℃，改为箱体温度降至-11℃。箱体温度-11℃的选择有两个原因，一是通过实测我们发现在程控降温前期-1℃/分钟的降温过程中，箱体和样本间的温差是趋于稳定的，在样本温度降至-7℃时，这个差异基本在4.5℃左右，即箱体温度在-11.5℃左右；二是通过对1119份脐带血的解冻后检测，我们发现大幅度降温开始时的箱体温度如果在-11.5℃以上，可以获得更好的解冻后cd34+细胞回收率（参见图5）。综合这两点，再考虑到样本提前相变的风险，本发明将该温度设置为-11℃。两种方法的程控降温曲线如图6和图7（蓝线，即最上面较为平直的曲线为标本温度，黄线为箱体温度，红线为设定温度，即下面两条重叠在一起的曲线分别为箱体温度和设定温度），可见相变阶段曲线没有明显差异。对使用两种方法批量冷冻的脐带血进行解冻后检测，cfu回收率未见显著差异，但可见使用箱体温度监测运行的程控降温的冻存效果更为一致，不同脐带血间的变异系数（cv）较小（参见图8）。