本发明属于人参培养
技术领域：
，具体涉及一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法。
背景技术：
：人参(panaxginsengc.a.meyer)属多年生药用草本植物，是中草药之王，具有很高的药用价值。人参的大多数药理作用归功于其次生代谢产物人参皂苷。其中人参皂苷rg1和re具有抗氧化、抗高血糖、保护神经和肝等多种药理作用。目前，人参主要依赖人工栽培，然而栽培人参生长周期长，常受病、虫、草害的困扰，而且皂苷含量也不稳定，经常受到环境因素的影响。为了解决这个问题，满足人们对人参皂苷的需要，人们尝试使用组织培养如愈伤组织、毛状根和不定根培养的方法生产人参皂苷。但是，现有的不定根培养得到的人参不定根，其所含的rg1和re含量有待进一步的提升。技术实现要素：本发明的目的是提供一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，通过在研制的在ms液体培养中添加营养椰壳粉和诱导因子脱落酸，有效促进了人参不定根皂苷rg1和re含量的提高。本发明是通过以下技术方案实现的。一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，包括以下操作步骤：(1)按重量份计，将1-6份氯化镧和15-20份l-羟基脯氨酸加入至250-300份水中，混合搅拌均匀后，向其中加入80-90份椰壳粉，混合搅拌均匀，静置处理后，过滤，得到营养椰壳粉；(2)制备ms液体培养基，所述ms液体培养基的配方为：ms基础培养基、40-60g/l的蔗糖、3.5-5.5mg/l的吲哚丁酸、80-90g/l的营养椰壳粉；(3)将人参不定根接种到ms液体培养基中，暗培养30-35天，向其中加入脱落酸，暗培养4-8天后，收获人参不定根。具体地，上述步骤(1)中，椰壳粉的平均粒径大小为120-150目。具体地，上述步骤(1)中，静置处理的时间为20-24小时。具体地，上述步骤(2)中，ms液体培养基的ph值为5.8-6.0。具体地，上述步骤(3)中，人参不定根需暗培养。具体地，上述步骤(3)中，加入脱落酸后的浓度为50-1000μmol/l。由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：与现有技术相比，本专利技术具有培养过程简单，在增加生物量的同时显著提高人参不定根皂苷rg1和re的含量的优点。本发明步骤(1)制得的营养椰壳粉，能有效促进不定根的生长，进而提高了人参不定根中人参皂苷rg1和re的含量，而脱落酸和营养椰壳粉中的l-羟基脯氨酸共同作用后，则能有效地提升人参不定根生物合成人参皂苷rg1和re的能力，最终使得本发明培育得到的人参不定根中含有较高含量的人参皂苷rg1和re，提升了人参不定根的营养价值。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。实施例1一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，包括以下操作步骤：(1)按重量份计，将1份氯化镧和15份l-羟基脯氨酸加入至250份水中，混合搅拌均匀后，向其中加入平均粒径大小为120目的80份椰壳粉，混合搅拌均匀，静置处理20小时后，过滤，得到营养椰壳粉；(2)制备ms液体培养基，所述ms液体培养基的配方为：ms基础培养基、40g/l的蔗糖、3.5mg/l的吲哚丁酸、80g/l的营养椰壳粉，其中ms液体培养基的ph值为5.8；(3)将人参不定根接种到ms液体培养基中，暗培养30天，向其中加入脱落酸，加入脱落酸后的浓度为450μmol/l，培养4天后，收获人参不定根。实施例2一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，包括以下操作步骤：(1)按重量份计，将3份氯化镧和18份l-羟基脯氨酸加入至280份水中，混合搅拌均匀后，向其中加入平均粒径大小为130目的85份椰壳粉，混合搅拌均匀，静置处理22小时后，过滤，得到营养椰壳粉；(2)制备ms液体培养基，所述ms液体培养基的配方为：ms基础培养基、50g/l的蔗糖、4.5mg/l的吲哚丁酸、85g/l的营养椰壳粉，其中ms液体培养基的ph值为5.9；(3)将人参不定根接种到ms液体培养基中，暗培养33天，向其中加入脱落酸，加入脱落后酸的浓度为500μmol/l，培养6天后，收获人参不定根。实施例3一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，包括以下操作步骤：(1)按重量份计，将6份氯化镧和20份l-羟基脯氨酸加入至300份水中，混合搅拌均匀后，向其中加入平均粒径大小为150目的90份椰壳粉，混合搅拌均匀，静置处理24小时后，过滤，得到营养椰壳粉；(2)制备ms液体培养基，所述ms液体培养基的配方为：ms基础培养基、60g/l的蔗糖、5.5mg/l的吲哚丁酸、90g/l的营养椰壳粉，其中ms液体培养基的ph值为6.0；(3)将人参不定根接种到ms液体培养基中，暗培养35天，向其中加入脱落酸，加入脱落后酸的浓度为550μmol/l，培养8天后，收获人参不定根。对比例1步骤(1)中，不添加营养椰壳粉，其余操作步骤与实施例1完全相同。对比例2步骤(1)中，营养椰壳粉中不添加l-羟基脯氨酸，其余操作步骤与实施例2完全相同。对比例3步骤(3)中不加入脱落酸，其余操作步骤与实施例3完全相同。分别用各实施例和对比例的方法得到人参不定根，然后测试人参不定根中人参皂苷rg1和re的含量，人参皂苷rg1和re含量的测定方法如下：(1)色谱条件：利用华谱c18反向色谱柱(5μm，4.6×250mm)，流动相a为水，流动相b为乙腈；流速为1ml/min；检测波长：203nm，柱温：25℃，进样体积为100μl，梯度洗脱条件：b泵浓度在0-13min为23％，13-33min为23→46％，33-45min为46→68％，45-60min为68→100％，60-66min为100→23％；(2)供试溶液的配制称取0.3g各实施例和对比例制得的人参不定根粉末于圆底烧瓶中，加入70ml70％甲醇，80℃恒温水浴锅中回流3小时，提取两次，将回流液体过滤，在60℃旋转蒸发浓缩至干，而后用10ml色谱级甲醇溶解，经过0.22μm的微孔滤膜去杂，过滤到10ml离心管中，即为供试溶液；(3)标准品溶液的制备：精确称取人参皂苷rg1和re标准品各1.0mg，使用5ml色谱级甲醇，充分涡旋使其完全溶解，将其制备成含单标浓度为0.2mg/ml的混合标准品溶液。人参皂苷rg1和re含量的测定结果如表1所示：表1人参皂苷rg1和re含量项目干重(g/l)人参皂苷rg1和re含量(mg/g)实施例17.51±0.266.54±0.38对比例15.94±0.183.71±0.15实施例27.21±0.286.67±0.40对比例27.11±0.273.94±0.07实施例37.18±0.216.76±0.32对比例37.28±0.311.83±0.16由表1中的实施例1和对比例1的数据可知，营养椰壳粉能有效的促进不定根的生长，进而提高了人参不定根中人参皂苷rg1和re的的含量；由实施例2和对比例2、实施例3和对比例3的数据可知，脱落酸和营养椰壳粉中的l-羟基脯氨酸共同作用后，则能有效的提升人参不定根生物合成皂苷rg1和re的人能力。本发明提供的一种提高人参不定根皂苷rg1和re含量的培养方法，培养过程简单，可实现大规模的工业化生产。以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。当前第1页12