本发明属于细胞保存
技术领域：
，具体涉及一种用于间充质干细胞的冷冻液及制备方法。
背景技术：
：间充质干细胞是一种多能干细胞，它具有干细胞的共性，即自我更新和多向分化能力。间充质干细胞不仅存在于骨髓中，也可以存在于骨骼肌、骨外膜和骨小梁中，间充质干细胞的分化组织类型十分广泛，间充质干细胞在临床应用中可以与造血干细胞联合应用，可以提高移植的成功率，加速造血重建。现有技术中，将优质低代数间充质干细胞进行冻存，在必要时进行复苏扩增是间充质干细胞临床应用中的必经程序，间充质干细胞在体外经过连续传代培养和冷冻复苏后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老或病变引起的组织器官的损伤修复，但是在低温条件下，大部分细胞由于内外环境中的谁会形成冰晶，导致细胞内结构机械性损伤，进一步使得细胞电解质升高、脱水、死亡，从而降低了细胞的存活率。在间充质干细胞的冻存过程中，需要处于对数生长期的细胞收集起来，加入特定成分的细胞冷冻液，分装于冻存管中，然后防止在超低温冰箱或者液氮中进行长期冻存。但是现有的细胞冷冻液在冻存间充质干细胞的效果并不理想，复苏后细胞回收率和细胞复活率较低。因此，急需一种能够解决现有问题的间充质干细胞的冷冻液及其制备方法。技术实现要素：本发明的目的是针对现有技术的不足，提供一种用于间充质干细胞的冷冻液及制备方法。本发明提供了如下的技术方案：一种用于间充质干细胞的冷冻液，包括按体积百分数计的如下组分：20wt％的人血清白蛋白5-30％、间充质干细胞条件培养基50-80％、羟乙基淀粉0.5-10％、山梨醇0.5-5％、硫辛酸0.1-1％、维生素d0.1-1％、维生素e0.1-1％以及二甲基亚砜和甘油混合物5-15％，其中，20wt％的人血清白蛋白的溶剂为生理盐水，所述间充质干细胞条件培养基为无血清基础培养基。优选的，各所述组分的体积百分数为：20wt％的人血清白蛋白10-30％、间充质干细胞条件培养基55-75％、羟乙基淀粉0.5-10％、山梨醇0.5-5％、硫辛酸0.1-1％、维生素d0.1-1％、维生素e0.1-1％以及二甲基亚砜和甘油混合物8-15％。优选的，所述无血清基础培养基为dmem/f12或rpmi1640。优选的，所述二甲基亚砜和甘油混合物中的二甲基亚砜和甘油的质量比为1：1.1-2。一种用于间充质干细胞的冷冻液的制备方法，包括如下步骤：s1、按照比例将间充质干细胞条件培养基和20wt％的人血清白蛋白进行混合；s2、按照比例配制二甲基亚砜和甘油混合物，将二甲基亚砜和甘油混合物加入到s1步骤所制备的混合物中，然后再依次继续加入羟乙基淀粉、山梨醇、硫酸锌、维生素d和维生素e，并混合搅拌均匀，然后在冰水浴中降温至0℃。优选的，在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储10-30min。本发明的有益效果是：本发明的冷冻液可用于长时间维持间充质干细胞的活性，采用本发明的冷冻液对间充质干细胞进行冻存后复苏，细胞的回收率和复活率较高，本发明的冷冻液中含有20wt％的人血清白蛋白5-30％、间充质干细胞条件培养基50-80％、羟乙基淀粉0.5-10％、山梨醇0.5-5％、硫辛酸0.1-1％、维生素d0.1-1％、维生素e0.1-1％以及二甲基亚砜和甘油混合物5-15％，其中山梨醇有助于将冷冻液的ph值调整到活性物质最稳定的区域，硫辛酸、维生素d和维生素e具有较强抗氧化性，防止细胞在冷冻过程中发生氧化变质，有效保护细胞活性，且多种抗氧化剂混合使用，具有更高的效力，本发明在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储，这样有助于避免二甲基亚砜对细胞的毒性。具体实施方式实施例1一种用于间充质干细胞的冷冻液，包括按体积百分数计的如下组分组成：包括按体积百分数计的如下组分：20wt％的人血清白蛋白15％、间充质干细胞条件培养基65％、羟乙基淀粉5％、山梨醇3％、硫辛酸1％、维生素d0.5％、维生素e0.5％以及二甲基亚砜和甘油混合物10％，其中，20wt％的人血清白蛋白的溶剂为生理盐水，所述间充质干细胞条件培养基为无血清基础培养基，所述无血清基础培养基为dmem/f12，所述二甲基亚砜和甘油混合物中的二甲基亚砜和甘油的质量比为1：1.2。一种用于间充质干细胞的冷冻液的制备方法，包括如下步骤：s1、按照比例将间充质干细胞条件培养基和20wt％的人血清白蛋白进行混合；s2、按照比例配制二甲基亚砜和甘油混合物，在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储10-30min，将二甲基亚砜和甘油混合物加入到s1步骤所制备的混合物中，然后再依次继续加入羟乙基淀粉、山梨醇、硫酸锌、维生素d和维生素e，并混合搅拌均匀，然后在冰水浴中降温至0℃。实施例2一种用于间充质干细胞的冷冻液，包括按体积百分数计的如下组分组成：包括按体积百分数计的如下组分：20wt％的人血清白蛋白15％、间充质干细胞条件培养基60％、羟乙基淀粉8％、山梨醇3％、硫辛酸1％、维生素d1％、维生素e0.5％以及二甲基亚砜和甘油混合物11.5％，其中，20wt％的人血清白蛋白的溶剂为生理盐水，所述间充质干细胞条件培养基为无血清基础培养基，所述无血清基础培养基为dmem/f12，所述二甲基亚砜和甘油混合物中的二甲基亚砜和甘油的质量比为1：1.5。一种用于间充质干细胞的冷冻液的制备方法，包括如下步骤：s1、按照比例将间充质干细胞条件培养基和20wt％的人血清白蛋白进行混合；s2、按照比例配制二甲基亚砜和甘油混合物，在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储10-30min，将二甲基亚砜和甘油混合物加入到s1步骤所制备的混合物中，然后再依次继续加入羟乙基淀粉、山梨醇、硫酸锌、维生素d和维生素e，并混合搅拌均匀，然后在冰水浴中降温至0℃。实施例3一种用于间充质干细胞的冷冻液，包括按体积百分数计的如下组分组成：包括按体积百分数计的如下组分：20wt％的人血清白蛋白20％、间充质干细胞条件培养基57％、羟乙基淀粉8％、山梨醇3％、硫辛酸1％、维生素d0.5％、维生素e1％％以及二甲基亚砜和甘油混合物9.5％，其中，20wt％的人血清白蛋白的溶剂为生理盐水，所述间充质干细胞条件培养基为无血清基础培养基，所述无血清基础培养基为dmem/f12，所述二甲基亚砜和甘油混合物中的二甲基亚砜和甘油的质量比为1：1.5。一种用于间充质干细胞的冷冻液的制备方法，包括如下步骤：s1、按照比例将间充质干细胞条件培养基和20wt％的人血清白蛋白进行混合；s2、按照比例配制二甲基亚砜和甘油混合物，在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储10-30min，将二甲基亚砜和甘油混合物加入到s1步骤所制备的混合物中，然后再依次继续加入羟乙基淀粉、山梨醇、硫酸锌、维生素d和维生素e，并混合搅拌均匀，然后在冰水浴中降温至0℃。取冻存前的细胞检测细胞数，每(1-2)×106细胞用1ml实施例1-3中所制备的冷冻液进行冻存，细胞置于冻存管加入冷冻液，放于程序降温盒中，然后放入-80℃过夜后，转入到液氮中进行长期冻存，冻存半年后，迅速在37℃水浴复苏后，计算细胞回收率和细胞活率，计算结果如表1所示。细胞回收率＝复苏后细胞数/冻存时的细胞数×100％细胞活率：细胞复苏后取样，用0.4％台盼蓝1:1染色后，置于显微镜下，计算活细胞数和死细胞数，细胞活率＝活细胞数/总细胞数100％表1检测结果实施例1实施例2实施例3细胞回收率98.3％96.1％96.2％细胞活率97.0％94.7％95.3％从表1中可以看出，采用本发明的冷冻液对间充质干细胞进行冻存后复苏，细胞的回收率和复活率较高，说明本发明的冷冻液可用于长时间维持间充质干细胞的活性。本发明的冷冻液中含有20wt％的人血清白蛋白5-30％、间充质干细胞条件培养基50-80％、羟乙基淀粉0.5-10％、山梨醇0.5-5％、硫辛酸0.1-1％、维生素d0.1-1％、维生素e0.1-1％以及二甲基亚砜和甘油混合物5-15％，其中山梨醇有助于将冷冻液的ph值调整到活性物质最稳定的区域，硫辛酸、维生素d和维生素e具有较强抗氧化性，防止细胞在冷冻过程中发生氧化变质，有效保护细胞活性，且多种抗氧化剂混合使用，具有更高的效力，本发明在配制二甲基亚砜和甘油混合物之前，需要将二甲基亚砜放入4℃的冰箱中冷冻存储，这样有助于避免二甲基亚砜对细胞的毒性。以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页12