一种脂肪干细胞运输保存液的制作方法

[0001]
本发明属于细胞生物学技术领域，具体涉及一种脂肪干细胞运输保存液。


背景技术：

[0002]
干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞。干细胞在生命科学的细胞修复、发育生物学、药物学等领域有着极为广阔的应用前景。具体地，其可在作为细胞治疗与组织器官替代治疗的种子细胞、探讨胚胎发育的调控机制、作为疾病基因治疗的载体、体外整合外源基因，研究基因功能、药物筛选平台的建立，药理研究与新药研发等多项研究中起到重要作用。目前，世界范围内已有干细胞药物产品上市，随着科技的发展，干细胞会更加有效和广泛的用于各种疾病的治疗，以弥补传统药物治疗对于某些疾病效果不佳的情况。细胞治疗、再生医学和干细胞研究中的最新进展已经显著增加了对各种类型的容易获得的细胞悬浮液的需求，在对一些待移植器官或组织的保存、运输等过程中，也对细胞生存的介质提出了更高的要求。既要确保器官、组织或细胞的生存能力，又要最大限度的保留其原有的生物学活性，同时还要防止其被细菌等污染，防止其死亡。
[0003]
脂肪干细胞在人体内储量丰富、通过抽脂从中获得的大量脂肪干细胞，有自我更新增殖及多向分化潜能，可向脂肪细胞、软骨细胞、肌细胞、成骨细胞、神经细胞、神经胶质细胞及胰岛细胞分化，而且可分泌多种促血管生成因子和抗凋亡因子而抗炎、抗氧化、可抵抗氧自由基的损伤，有望成为修复损伤的组织和器官的来源。
[0004]
目前已经有相关文献公开的细胞运输方式有三种，一种是在液氮低温下进行非细胞培养状态运输，第二种是在2-8℃低温条件下运输，第三种是常温运输。其中液氮低温下进行非细胞培养状态运输成本高，冻存液成分不明确，细胞经过冻存其活性会下降，对后续实验造成一定的影响，且运输的成本高。第二种运输方式也要求采用相应的能够保持低温的工具，确保干细胞处于恒定的2-8℃低温条件下。目前的常温运输存在细胞存活率低的问题，有待进一步改进。


技术实现要素：

[0005]
本发明提供一种脂肪干细胞运输保存液，以解决现有技术中脂肪干细胞常温运输时细胞存活率低的问题。
[0006]
本发明的干细胞运输保存液采用如下技术方案：一种脂肪干细胞运输保存液，所述脂肪干细胞运输保存液的组分包括柠檬酸钠、生理盐水、人参皂苷、海藻酸钠、苦瓜汁、吡咯烷酮羧酸钠和角鲨烷。
[0007]
作为进一步优选的技术方案，所述柠檬酸钠的浓度为0.01-0.3wt％，所述人参皂苷的浓度为1-10μg/ml，所述海藻酸钠的浓度为0.08-3wt％，所述苦瓜汁的体积百分数为0.5-5％，所述吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.1-0.5μg/ml，所述角鲨烷的浓度为10-80μg/ml。
[0008]
作为进一步优选的技术方案，所述柠檬酸钠的浓度为0.05wt％，所述人参皂苷的
浓度为5μg/ml，所述海藻酸钠的浓度为2wt％，所述苦瓜汁的体积百分数为2％，所述吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.3μg/ml，所述角鲨烷的浓度为50μg/ml。
[0009]
作为进一步优选的技术方案，所述苦瓜汁通过对苦瓜榨汁并经0.22微米滤膜过滤后制备得到。
[0010]
作为进一步优选的技术方案，所述脂肪干细胞运输保存液按照下述方法制备得到：先向所述生理盐水中加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁混合均匀；之后再加入吡咯烷酮羧酸钠、角鲨烷和海藻酸钠，所得均匀混合液即为所述脂肪干细胞运输保存液。
[0011]
作为进一步优选的技术方案，所述脂肪干细胞运输保护液为常温干细胞运输保存液。
[0012]
作为进一步优选的技术方案，所述脂肪干细胞运输保护液的用量为5
×
105cells/ml-1
×
106cells/ml。
[0013]
本发明的有益效果是：本发明的脂肪干细胞运输保护液可实现干细胞的常温运输，且4-37℃温度范围内均对脂肪干细胞有很好的保护作用，细胞存活率高。
[0014]
苦瓜汁中含有多种活性成分，例如植物胰岛素、苦瓜素、多肽、糖类和氨基酸等，具有降血糖、抗氧化和抗菌等多种功能。发明人在研究中发现苦瓜汁用于干细胞的常温保存/运输，可起到提高细胞存活率的作用；海藻酸钠有助于改善本发明的干细胞运输保存液对细胞的保护作用的持久性，以在更长的运输时间内为细胞提供保护；吡咯烷酮羧酸钠和角鲨烷的存在使得本发明的运输保护液可减少运输过程中干细胞对温度的敏感性，使得干细胞可在4-37℃的温度范围内运输时均可保持较高的细胞存活率。
[0015]
本发明的干细胞运输保存液在常温运输的情况下，72h细胞存活率可达80％以上。
具体实施方式
[0016]
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0017]
实施例1
[0018]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.05wt％，人参皂苷的浓度为5μg/ml，海藻酸钠的浓度为2wt％，苦瓜汁的体积百分数为2％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.3μg/ml，角鲨烷的浓度为50μg/ml。
[0019]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为8
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0020]
实施例2
[0021]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后
保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.01wt％，人参皂苷的浓度为8μg/ml，海藻酸钠的浓度为1.5wt％，苦瓜汁的体积百分数为4％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.5μg/ml，角鲨烷的浓度为20μg/ml。
[0022]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为8
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0023]
实施例3
[0024]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.1wt％，人参皂苷的浓度为10μg/ml，海藻酸钠的浓度为1wt％，苦瓜汁的体积百分数为3％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.1μg/ml，角鲨烷的浓度为80μg/ml。
[0025]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为5
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0026]
实施例4
[0027]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.3wt％，人参皂苷的浓度为6μg/ml，海藻酸钠的浓度为3wt％，苦瓜汁的体积百分数为5％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.2μg/ml，角鲨烷的浓度为60μg/ml。
[0028]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为1
×
106cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0029]
实施例5
[0030]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.01wt％，人参皂苷的浓度为2μg/ml，海藻酸钠的浓度为0.08wt％，苦瓜汁的体积百分数为2％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.4μg/ml，角鲨烷的浓度为40μg/ml。
[0031]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为5
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0032]
实施例6
[0033]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜
苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.1wt％，人参皂苷的浓度为3μg/ml，海藻酸钠的浓度为1.5wt％，苦瓜汁的体积百分数为0.5％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.5μg/ml，角鲨烷的浓度为10μg/ml。
[0034]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为6
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0035]
实施例7
[0036]
干细胞运输保存液：向生理盐水中分别加入柠檬酸钠、人参皂苷和苦瓜汁(将新鲜苦瓜榨汁后，经0.22μm滤膜过滤后得到；最好是即制即用，若需要多次分批使用，可分装后保存于4℃冰箱中备用)混合均匀，之后再加入海藻酸钠，得到均匀混合液，即为干细胞运输保存液。该干细胞运输保存液中各成分的终浓度为：柠檬酸钠的浓度为0.12wt％，人参皂苷的浓度为1μg/ml，海藻酸钠的浓度为1.5wt％，苦瓜汁的体积百分数为3.5％，吡咯烷酮羧酸钠的浓度为0.3μg/ml，角鲨烷的浓度为50μg/ml。
[0037]
干细胞的运输：将脂肪干细胞均匀分散于干细胞运输保存液中，使干细胞的浓度为7
×
105cells/ml，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，并分别在第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率(台盼蓝染色法)。
[0038]
对比例1
[0039]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括海藻酸钠；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0040]
对比例2
[0041]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括人参皂苷；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0042]
对比例3
[0043]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括苦瓜汁；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0044]
对比例4
[0045]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括柠檬酸钠(ph与实施例1相同)；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0046]
对比例5
[0047]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括吡咯烷酮羧酸钠；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0048]
对比例6
[0049]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括角鲨烷；将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在25℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0050]
对比例7
[0051]
与实施例1的区别仅在于将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在4℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0052]
对比例8
[0053]
与实施例1的区别仅在于将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在37℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0054]
对比例9
[0055]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括吡咯烷酮羧酸钠且将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在37℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0056]
对比例10
[0057]
与实施例1的区别仅在于干细胞运输保存液的组份不包括角鲨烷且将脂肪干细胞均匀混悬于该干细胞运输液后，模拟运输72h(模拟运输时温度控制在37℃)，第0h、24h、48h和72h时取样测定细胞存活率。
[0058]
细胞存活率的测定结果如下表1所示：
[0059]
表1
[0060][0061][0062]
由上表1可知，采用本发明的干细胞运输保存液在常温运输的情况下，24h细胞存活率可达90％以上，48h细胞存活率可达85％以上，72h细胞存活率可达80％以上；实施例1的干细胞运输保存液对细胞的保护作用最佳。
[0063]
结合对比例1可知，在不添加海藻酸钠的情况下，48h之后本发明的干细胞运输保存液对干细胞的保护作用相对实施例1下降的更快，表明海藻酸钠可使本发明的干细胞保存液对干细胞提供更持久的保护。
[0064]
结合对比例2和3可知，本发明的干细胞运输保存液中人参皂苷和苦瓜汁均对维持细胞的存活率有重要作用，且苦瓜汁对细胞存活率的影响最大。
[0065]
结合对比例4可知，柠檬酸钠除影响干细胞运输保存液的ph外，还可起到与其他组分协同的保护细胞的作用。
[0066]
结合对比例7和8可知，本发明的干细胞运输保存液对细胞的保护作用在一定范围内受温度的影响较小，可适用于多种环境下干细胞的运输。
[0067]
结合对比例5和对比例9以及对比例6和对比例10可知，吡咯烷酮羧酸钠和角鲨烷除可起到改善干细胞常温运输的存活率的作用外，还可起到减小温度变化对细胞存活率的影响，使得在使用本发明的干细胞运输保存液时细胞在37℃的运输条件下仍能维持更好的存活率；且吡咯烷酮羧酸钠的效果相较于角鲨烷更好。
[0068]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。